Экс Utero электропорации и Органотипической фрагмент Культура мыши ткани гиппокампа

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы пометить и модифицировать отдельные клетки зубчатой извилины и проследить за их развитием. Это достигается путем первой инъекции ДНК в одно полушарие мозга на эмбриональный день, 15,5 или 18,5 лет. Второй шаг заключается в электропорации введенной ДНК в развивающуюся область зубчатой извилины.

Затем срезы мозга подготавливаются с помощью вибратора, и срезы мозга хранятся в культуре до 14 дней. Завершающим этапом является иммунофлуоресцентное окрашивание срезов мозга с использованием соответствующих антител. В конечном счете, конфокальная иммунофлуоресцентная микроскопия используется для отображения изменений модифицированных гранулярных клеток развивающейся зубчатой извилины.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как роль конкретных генов в развитии специфических нейрональных клеток в различных областях мозга. В нашем случае транскрипционный фактор BC 11 B в развитии извилин. Начните процедуру с рассечения матки усыпленной мыши, в которой находятся эмбрионы.

Поместите его в чашку Петри, содержащую от 15 до 20 миллилитров холодного полного HBSS на льду. Затем с помощью ножниц отделите каждый эмбрион от маточного рога. Затем поместите его во вторую чашку Петри, содержащую холодный полный HBSS, под препарирующий микроскоп, разрежьте мышечную стенку матки.

Осторожно освободите эмбрион от желточного мешка и плаценты. Затем. С помощью ножниц для скота обезглавьте эмбрионы чуть выше передних конечностей под углом 60 градусов.

Если эксперимент требует генотипирования эмбрионов, соберите образец ткани для выделения геномной ДНК. Затем переложите голову в чистую и сухую чашку Петри. Поскольку голова была обезглавлена под углом 60 градусов, она должна наклоняться в одну сторону, если ее положить спинной стороной вверх.

Теперь осторожно поместите иглу в середину полусферы, ближе к bgma. Введите примерно два-три микролитра раствора ДНК, нажимая на педаль пико-шпритцера. В-третьих, с использованием давления в 30 фунтов в течение 10-15 миллисекунд на импульс.

Подача от пяти до восьми импульсов с интервалом в одну секунду. Перед установкой электродов нанесите несколько капель полного HBSS на головку эмбриона О. Затем расположите электроды таким образом, чтобы отрицательная клемма находилась на той же стороне, что и инъецируемый желудочек, и положительный электрод на противоположной стороне инъецируемого желудочка ниже уха головы эмбриона. Затем подайте пять импульсов по 50 вольт.

После электропорации. Поместите голову эмбриона в посуду, содержащую от 15 до 20 миллилитров холодного полного раствора HBSS. Снимите кожу с головы эмбриона.

Затем сделайте небольшой разрез посередине мозжечка по средней линии черепа. Вставьте пружинные ножницы в разрез и разрежьте продольно по сагиттальному шву. Отклейте череп и отделите от него мозг.

Тем временем вылейте 4% LMP aros в форму для снятия пленки и очистите ее при комнатной температуре. Извлеките мозг из полного HBSS с помощью небольшого шпателя и слейте излишки HBSS с помощью тонкой папиросной бумаги или химической салфетки. Аккуратно поместите весь мозг в агаровые розы и отрегулируйте его положение с помощью тонкой иглы.

Держите форму на льду до тех пор, пока агаровая роза не застынет и блок не будет разделен. Теперь обрежьте блок LMP agros и приклейте его к стадии образца с помощью суперклея. После того как клей высохнет, перенесите ступень образца в буферный лоток вибратора.

Заполните его ледяным полным HBSS до тех пор, пока блок не будет погружен в раствор. Чтобы подготовиться к секционированию, установите вибратор на соответствующие настройки. Разрежьте срезы, содержащие нужную ткань, с медленной скоростью, начиная с заднего мозга, и соберите пять-семь срезов из головного мозга.

Затем переложите секции в чистую чашку для шести лунок, содержащую пять миллилитров ледяного холода, заполните HBSS и держите ее на льду, пока все секции не будут собраны. Затем поместите мембранные вставки в шестилуночную пластину, содержащую 1,8 миллилитров среды для срезов культуры. Смочите мембрану крест-накрест 100 микролитрами полного HBSS перед размещением секций на мембране, чтобы облегчить ориентацию секций.

Затем перенесите срезы на мембрану. Размещайте на одной мембране до пяти секций, и не накладывайте секции друг на друга. Удалите излишки HBSS с мембраны с помощью пипетки.

Инкубируйте чашку для культуры при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 11 или 14 дней in vitro и меняйте половину среды через день. На этом этапе добавляют в среду реагенты, такие как бромдезоксиуридин для мечения пролиферирующих клеток в течение первых 20 часов времени культивирования. На этом этапе используйте чистое и острое лезвие скальпеля, чтобы обрезать мембрану в соответствии с ориентацией секций.

Перенесите срезы вместе с мембраной в 24-луночный планшет, содержащий один миллилитр 4%-ного PFA, и инкубируйте срезы в течение одного часа при комнатной температуре. Далее вымойте их три раза одним XPBS по 15 минут при каждой стирке. Затем инкубируйте срезы в течение ночи с проницаемым раствором при четырех градусах Цельсия с легким перемешиванием на следующий день, инкубируйте срезы с соответствующими первичными антителами, разведенным и проницаемым раствором в течение ночи или в течение 48 часов при четырех градусах Цельсия с легким перемешиванием.

После этого промойте срезы три раза в течение 15 минут одним XPBS и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия с соответствующими вторичными антителами, разведенным и проницаемым раствором. После инкубации промойте срезы один раз одним XPBS в течение 15 минут, после чего последует окрашивание в течение 10 минут в конце, промойте срезы три раза одним XPBS в течение 15 минут каждый и перенесите на предметные стекла микроскопа. Добавьте иммуномонтер и аккуратно.

Сверху на секции положите защитный лист. Высушите предметные стекла на ночь при температуре четыре градуса Цельсия и запечатайте лаком для ногтей, прежде чем анализировать их с помощью конфокальной микроскопии. Здесь показана инъекция ДНК, экспрессирующей GFP, в одно полушарие с последующим иммуноокрашиванием на 18,5-й день после электропорации.

На этом изображении показано окрашивание DPI, окрашивание GFP показано на этом изображении, а объединенное изображение показано здесь. На этом рисунке показано мозаичное делеция BCL 11 B с помощью X-матки, электропорации с последующим органотипическим срезом. Срезы культур иммуноокрашивали с использованием антител, распознающих GFP и NeuroD, вставки, отображающие GFP и BCL L 11 B. Окрашивание при более высоком увеличении демонстрирует потерю экспрессии BCL 11 B в клетках, экспрессирующих рекомбиназу кри.

Вот статистический анализ GFP, нейро D и GFP нейро D положительных клеток. После освоения этой техники ее можно проводить в течение двух с половиной часов для четырех эмбрионов, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о бережном обращении с тканью и избегать ее загрязнения.