Busulfan как Myelosuppressive агента по приносящей стабильные высокого уровня костного мозга химеризм у мышей

Общая цель данной процедуры заключается в замене костного мозга реципиентных мышей клетками костного мозга донорных мышей, повсеместно экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок, без использования облучения. Это достигается путем предварительного кондиционирования реципиентной мыши серией внутрибрюшинных инъекций миелосупрессивного препарата бусульфана.

Затем клетки костного мозга выделяют из бедренных и большеберцовых костей мыши-донора, во всех тканях которой экспрессируется зеленый флуоресцентный белок. Наконец, клетки костного мозга донора пересаживают мыши-реципиенту, прошедшей предварительную подготовку, путем инъекции в хвостовую вену. В конечном итоге у пересаженной мыши берут кровь и анализируют ее методом проточной цитометрии, чтобы оценить степень химеризма костного мозга.

Основными преимуществами данного метода по сравнению с существующими способами, такими как полное облучение тела, является возможность достижения высокой степени приживления костного мозга без цитотоксических эффектов полного облучения тела и без необходимости использования специализированных помещений и оборудования. Этот метод не только позволяет изучить накопление клеток, производных костного мозга, в центральной нервной системе, но также может быть использован для исследования таких тем, как развитие гемопоэтических линий, иммунобиология и лейкемия. Для кондиционирования мышей-реципиентов подготовьте разведенный бусульфан согласно текстовому протоколу и вводите его мышам-реципиентам внутрибрюшинно в дозе 20 mg/kg ежедневно.

После эвтаназии мышей в соответствии с правилами учреждения, в ламинарном шкафу опрыскайте мышь 70% ethanol. Приподнимите кожу в области живота и с помощью хирургических ножниц сделайте надрез кожи от брюшной полости вверх по ноге к лодыжке, удерживая стопу. Плотно оттяните кожу от лодыжки к бедру, обнажая ткани конечности.

Обрежьте мышцы и жир с бедренной кости, чтобы обнажить тазобедренный сустав, осторожно потянув за стопу. Чтобы выпрямить ногу, прижмите ножницы к тазовым костям и сделайте разрез чуть выше головки бедренной кости, стараясь не повредить саму кость. Для поддержания стерильности держите ногу за стопу и удалите остатки тканей с бедренной кости с помощью ножниц и автоклавированных тканей, чтобы протереть поверхность кости.

Отделите бедренную кость от большеберцовой, разрезав коленный сустав, и поместите бедренную кость в чашку для культивирования с PBS, инкубируя на льду. Затем удалите и выбросьте малоберцовую кость, разрезав ее в точках соединения с большеберцовой костью. После этого очистите большеберцовую кость.

Удалите стопу, перерезав большеберцовую кость в месте окончания красного костного мозга, и поместите большеберцовую кость в чашку с культурой вместе с бедренной костью, затем инкубируйте на льду. Используя пинцет, удерживайте бедренную кость и с помощью хирургических ножниц осторожно срежьте дистальные концы кости. Удалите минимальное количество костной ткани, необходимое для обнажения костномозговой полости, используя три миллилитра стерильного PBS.

Наполните шприц и установите иглу калибра 23. Осторожно введите иглу в костномозговую полость и промойте её, чтобы переместить костный мозг в стерильную чашку для культивирования. Используйте кончик иглы, чтобы соскоблить содержимое костномозговой полости, обеспечив полное извлечение всех необходимых клеток после экстракции.

Убедитесь, что красный костный мозг больше не виден, а кость теперь выглядит белой. С помощью пинцета зафиксируйте большеберцовую кость и хирургическими ножницами осторожно сбрейте край в месте ее прикрепления к коленному суставу. Для вскрытия костномозговой полости наполните шприц тремя миллилитрами стерильного PBS и установите иглу калибра 25 gauge.

Осторожно введите иглу в костномозговую полость и промойте костный мозг в чашку с собранным костным мозгом из бедренных костей. С помощью наконечника дозатора на 1 мл аккуратно тритурируйте костный мозг для диссоциации клеток. Пропустите клеточную суспензию через фильтр-сетку с порами 40 мкм в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл.

Используйте PBS для промывки чашки, чтобы собрать все оставшиеся клетки, и перенесите буфер через фильтр в центрифужную пробирку. Добавьте в пробирку PBS до достижения конечного объема 30–40 мл и центрифугируйте при 450 ×g и четырех градусах °C в течение пяти минут. Затем удалите и утилизируйте супернатант.

Ресуспендируйте осадок в трех миллилитрах буфера для лизиса эритроцитов и инкубируйте на льду в течение 8,5 минут. Затем добавьте около 30 миллилитров стерильного PBS для нейтрализации лизирующего буфера, центрифугируйте и удалите супернатант. Используйте один миллилитр стерильного PBS для ресуспендирования осадка и храните его на льду.

Разбавьте небольшое количество гомогената клеток с помощью PBS и используйте гемоцитометр для подсчета клеток. Доведите концентрацию клеточной суспензии до 8 × 10⁶ клеток/мл и выдерживайте на льду до момента инъекции. Для проведения трансплантации костного мозга наберите 300 µL разбавленной клеточной суспензии в шприц объемом 0,5 мл.

Перед введением препарата каждому подопытному мышю необходимо удалить все пузырьки воздуха. Поместите клетку с подготовленными мышами-реципиентами на грелку, чтобы латеральные хвоставые вены расширились. Поместите мышь-реципиента в фиксатор подходящего размера и протрите хвост хирургической марлей, смоченной в 70% ethanol; крепко удерживая хвост, осторожно введите иглу срезом вверх в одну из латеральных хвоставых вен и введите клеточную суспензию.

Прижимайте хирургическую марлю к месту инъекции до остановки кровотечения. Примерно через две-три недели после трансплантации костного мозга, перед помещением мыши в новую чистую клетку, поместите ее в фиксационную трубку и выбрейте шерсть на задней конечности, чтобы открыть латеральную сафеническую вену. Затем нанесите тонкий слой вазелина на конечность и с помощью иглы 25-го калибра введите в сафеническую вену капиллярную трубку с гепариновым покрытием.

Соберите около 50 µL крови, затем используйте хирургическую марлю, чтобы остановить кровотечение. После остановки кровотечения верните мышь в клетку. Добавьте кровь в микроцентрифужную пробирку, содержащую один мл буфера FAX.

Перемешайте содержимое пробирки путем переворачивания и храните на льду; центрифугируйте образцы крови при 900 ×g в течение пяти минут. После удаления и утилизации супернатанта используйте 500 µL буфера для лизиса эритроцитов, чтобы ресуспендировать осадок, и инкубируйте на льду в течение 8,5 минут. Затем добавьте 1 мл буфера FACS, чтобы нейтрализовать действие лизирующего буфера, и центрифугируйте при 900 ×g в течение пяти минут.

После повторного лизиса и центрифугирования, согласно текстовому протоколу, убедитесь, что осадок стал белым. Если он остается красным, повторите этап лизиса в третий раз. Ресуспендируйте осадок в буфере FACS и используйте проточную цитометрию для количественного определения доли GFP-положительных клеток.

На этом графике показаны уровни химеризма, количественно определенные еженедельно в периферической крови мышей, которым вводили 100 мг/кг бузалана перед успешной сингенерической трансплантацией костного мозга, и мышей, которым вводили 80 мг/кг бузалана перед неудачной аллогенной трансплантацией костного мозга. Уровни химеризма более 80% обычно устанавливаются через три-четыре недели после трансплантации костного мозга; здесь представлены репрезентативные данные периферической крови, демонстрирующие успешную и неудачную трансплантацию костного мозга через три недели после процедуры. Эти данные проточной цитометрии показывают, что высокая степень химеризма сохраняется в костном мозге на протяжении как минимум одного года и что кондиционирование растворителем недостаточно для индуцирования химеризма костного мозга.

Хотя при использовании доз бусульфана от 60 до 100 миллиграммов на килограмм значительных различий в уровнях химеризма костного мозга не наблюдается, GFP-положительные клетки накапливаются в центральной нервной системе дозозависимым образом. На данном рисунке показано накопление GFP-положительных клеток костного мозга в поясничном отделе спинного мозга мыши дикого типа и в еще большей степени в мышиной модели нейродегенеративного заболевания — бокового амиотрофического склероза. При выполнении данной процедуры важно использовать сингенеичных мышей-реципиентов и доноров одного пола, чтобы минимизировать вероятность отторжения трансплантата после проведения процедуры.

Для изучения механизмов проникновения клеток, происходящих из костного мозга, в центральную нервную систему могут быть использованы другие методы, такие как проточная цитометрия и иммуногистохимия.