Мышиной модели необратимые и обратимые одностороннего мочеточника непроходимости

В данном видео представлена модель обструктивной нейропатии у мышей, индуцированной односторонней обструкцией мочеточника, которая может быть необратимой или обратимой; представлены гистологические данные, демонстрирующие возникшее структурное повреждение и его восстановление после устранения обструкции. На этой схеме проиллюстрированы основные этапы данной модели. Здесь показаны левая почка, мочеточник и мочевой пузырь.

Стандартная односторонняя обструкция мочеточника индуцируется путем перевязки мочеточника. Со временем мочеточник расширяется, а в почке развивается гидронефроз. Для создания обратимой односторонней обструкции мочеточника мочеточник перевязывают рядом с мочевым пузырем, а вокруг него в точке обструкции устанавливают пластиковую трубку с мягкими стенками, показанную серым цветом.

Чтобы ограничить чрезмерное расширение мочеточника, в почке со временем развивается гидронефроз, после чего в подходящий для исследования момент проводят устранение обструкции. На седьмой день эксперимента мягкую трубку удаляют, а мочеточник пересекают чуть выше уровня лигирования. Необструктированный мочеточник анастомозируют с мочевым пузырем для обеспечения оттока мочи, после чего декомпрессия почки обычно происходит в течение нескольких дней.

Модель односторонней обструкции мочеточника (UUO) может быть использована для изучения развития повреждения тканей и фиброза при обструктивной нефропатии. Модель обратимой обструкции мочеточника (RUUO) позволяет получить представление о ремоделировании тканей, которое может следовать за повреждением. Ниже представлено описание типичного эксперимента, включающего обе процедуры: UUO и RUUO.

Мышам проводят одностороннюю обструкцию мочеточника (UUL) в нулевой день, и семь дней спустя мышей либо подвергают эвтаназии для оценки степени повреждения, либо проводят деобструкцию мочеточников для выполнения процедуры RUUR. Затем почкам дают декомпрессироваться в течение семи дней перед забором тканей.

Ткань можно оценить на предмет структурных повреждений, инфильтрации макрофагами, накопления миофибробластов и фиброза. Ниже представлена типичная хирургическая установка. Процедура выполняется с использованием стерильных инструментов и расходных материалов, прошедших автоклавирование и размещенных в стерильном хирургическом поле.

Если операция проводится нескольким животным, инструменты следует стерилизовать между процедурами с помощью бусового стерилизатора или использовать новый набор инструментов для каждой процедуры. Операторы надевают стерильный халат, маску, шапочку и перчатки. Этай восьминедельная мышь линии C 57 black 6 была анестезирована путем внутрибрюшинной инъекции кетамина, гидрохлорида и мидазолама.

Глубина анестезии была подтверждена отсутствием реакции на защемление пальца ноги. Операционное поле выбрили и санировали с помощью разбавленного раствора хлоргексидина. Для предотвращения пересыхания роговицы в глаза ввели увлажняющее средство.

Анальгетик бупренорфина гидрохлорид был введен путем подкожной инъекции. Рот поместили на стерильную прогреваемую хирургическую подложку, конечности иммобилизировали с помощью ножниц для разделения тканей, после чего выполнили срединную лапаротомию и разрез вдоль аваскулярной линии локтя. В следующей главе будет подробно описано, как выполнить необратимую UUOA; в разрез вставляют ретрактор Calibra, а мышь накрывают стерильными салфетками.

Кишечник отодвигают и прикрывают влажной стерильной марлей, чтобы открыть доступ к левому мочеточнику. Мочеточник обнажают и изолируют с помощью изогнутого пинцета для создания обструкции. Мочеточник перевязывают дважды, используя черную плетеную шелковую нить размера 6-0.

Обструкция мочеточника может быть создана в любом месте между мочевым пузырем и почечной лоханкой. Затем мочеточник рассекают между швами. В следующей главе подробно описывается способ создания обратимой обструкции мочеточника.

Это первый этап операции RUUL. Мочеточник обнажают и изолируют с помощью угловых зажимов для моделирования обструкции. Мочеточник перевязывают дважды, используя черный плетеный шелковый шовный материал 6.0.

Мочеточник следует перевязать близко к мочевому пузырю, чтобы сохранить достаточную длину мочеточника для последующего анастомоза с мочевым пузырем. В ходе процедуры восстановления швы обрезают, оставив один длинным для последующего использования, и отрезают фрагмент мягкого пластикового гибкого трубки длиной примерно пять миллиметров. Затем в трубке делают продольный разрез, чтобы ее можно было развернуть и наложить вокруг мочеточника.

Пластическая трубка с мягкими стенками должна иметь внутренний диаметр 1 мм и внешний диаметр 2 мм. Трубку с мягкими стенками осторожно помещают вокруг мочеточника, следя за тем, чтобы после затягивания длинный конец шовного материала выходил из центра прорези. Затем вокруг трубки пропускают и завязывают отрезок плетеного шелкового шовного материала черного цвета размера 6-0.

Затем длинная нить шва, выходящая из центра трубки, включается в следующий узел. Это выполняется для надежной фиксации мочеточника и трубки на месте. Трубка вокруг мочеточника предотвратит чрезмерное расширение мочеточника в конце процедур как UUO, так и RUUO.

Кишечник возвращают на место, брюшину зашивают, а кожу закрывают металлическими скобами. На область хирургического вмешательства также наносят йод. Анестезию частично купируют подкожным введением aamaz.

Гидрохлорид и жидкости вводят путем подкожной инъекции 1 мл подогретого физиологического раствора. За мышами наблюдают до восстановления сознания, после чего их помещают для восстановления в термостат при температуре 29 °C на 24 часа. В течение нескольких дней после обструкции мочеточников в почках развивается гидронефроз.

Мышей можно подвергнуть эвтаназии в различные моменты времени в фазе повреждения или после устранения обструкции. В следующей главе подробно описывается процедура устранения обструкции, которая является вторым этапом процедуры RUUO. Мышь анестезируют и подготавливают так же, как было описано ранее.

Металлические зажимы для кожи удаляют и выполняют лапаротомию. Швы на брюшине удаляют, после чего брюшину осторожно вскрывают с помощью зубчатого пинцета для крыс. Затем подготавливают мышь и обнажают левый мочеточник, как было описано ранее, используя изогнутый пинцет.

Мочеточник и мягкий пластиковый катетер изолируют от окружающих тканей. Нити, удерживающие мягкий катетер на месте, перерезают скальпелем и удаляют. Затем осторожно извлекают мягкий пластиковый катетер, после чего становится виден расширенный мочеточник.

Мочеточник в месте обструкции становится хрупким и может легко разорваться выше места закупорки, как это произошло в данном видеоролике. Однако швы, наложенные ранее рядом с мочевым пузырем на первом этапе UUO, останутся неповрежденными, что предотвратит вытекание мочи из мочевого пузыря в брюшную полость. Под мочеточник помещают кусочек стерильной марли для сбора любого мочевого осадка, который будет вытекать из ранее обтурированного мочеточника.

Необходимо дать возможность остальной части ранее обтурированного мочеточника дренироваться до появления прозрачной мочи, чтобы убедиться, что просвет мочеточника полностью очищен от любых остатков. После дренирования мочеточника и почечной лоханки на конец мочеточника накладывается длинная шелковая плетёная нить черного цвета размера 6-0. Она используется для облегчения последующего наложения анастомоза между мочеточником и мочевым пузырем.

Затем мочеточник поворачивают так, чтобы он располагался спереди относительно своего первоначального положения и лежал поверх почки. На конце мочеточника накладывают один шов из нанополиамидной мононити. Следует проявлять осторожность, чтобы шов оставался в мышечном слое и не проникал в просвет мочеточника.

Шовный материал используется для фиксации мочеточника в мочевом пузыре. Впоследствии, чтобы подготовить мочевой пузырь к анастомозу, в нем создается канал путем диагонального проведения иглы 21G через мочевой пузырь. Затем с помощью иглы 21G через мочевой пузырь проводят иглу с ушком. Ранее установленная в мочеточнике нить Нино затем проводится через первый разрез в мочевом пузыре и выводится через стенку мочевого пузыря рядом с точкой входа, чтобы провести мочеточник через мочевой пузырь.

Длинную шовную нить 6-0, наложенную на конец мочеточника, проводят через ушко иглы. После этого иглу медленно вытягивают через мочевой пузырь, обеспечивая одновременное протягивание мочеточника в полость пузыря. После того как мочеточник окажется внутри мочевого пузыря, наложенные на мочеточник и стенку пузыря наношвы завязывают, чтобы надежно зафиксировать мочеточник на месте.

Налагают второй шов по методу Отакса. Его снова проводят через мочеточник, следя за тем, чтобы он оставался в пределах мышечной оболочки, затем через разрез мочевого пузыря и выводят через стенку мочевого пузыря. После этого шов завязывают аналогичным образом.

Третий нанотекстурный шов также накладывается на заднюю стенку мочевого пузыря. Затем тыльной стороной раскрытых ножниц слегка отодвигают стенку мочевого пузыря, чтобы обнажить длину мочеточника. После этого мочеточник пересекают выше легочного шва.

Затем окрашенный мочеточник втягивается в мочевой пузырь под углом. Используются четыре зажима, чтобы убедиться, что мочеточник полностью втянулся в мочевой пузырь. В завершение место выхода в мочевом пузыре закрывают полиамидной монофиламентной нитью размера 9-0; перед закрытием необходимо убедиться, что мочеточник надежно зафиксирован внутри мочевого пузыря.

Зашейте брюшину и кожу, как описано ранее, и обеспечьте послеоперационный уход согласно ранее изложенным инструкциям. В данном исследовании всем мышам с моделью UUO дают восстановиться в течение семи дней, чтобы обеспечить декомпрессию разблокированной почки, хотя могут быть изучены и другие временные точки. Далее представлены данные, иллюстрирующие внешний вид обструктурированных и разблокированных почек, а также возникшее в результате повреждение.

На этом рисунке показан вид почек, почечных лоханок и мочеточников при моделях U-U-L-U-U-O и RUO в сравнении с нативной почкой. Почка при UUO, в которой обструкция сохранялась в течение семи дней, выглядит гидронефротической и бледной. После семи дней деобструкции почка при RUO подверглась декомпрессии, а почечная лоханка и мочеточник вернулись к размеру и цвету, соответствующим нативной почке.

Обратите внимание, что мочеточник при IUO короче, чем мочеточники при UUO и в нативных почках, из-за техники деструктуризации и выполнения анастомоза с мочевым пузырем. На данном рисунке представлены репрезентативные изображения срезов почек, окрашенных гематоксилином и эозином (H и E), от нативных почек при UUO и RUUO. Здоровая интерстициальная ткань нормальной почки состоит из поперечных срезов компактных здоровых канальцев.

Ряд канальцев, отмеченных черными стрелками, демонстрируют выраженную дилатацию на седьмой день. После QUL в контрольной трубке дилатация заметно уменьшается через семь дней после отмены UUL. Представленная здесь модель обструктивной нефропатии у мышей индуцируется односторонней обструкцией мочеточника, которая может быть либо необратимой, либо обратимой.

Описанная здесь обратимая модель позволяет устранить обструкцию мочеточника и выполнить анастомоз мочеточника с мочевым пузырем для полного восстановления тока мочи. Последующая декомпрессия почки позволяет изучать ремоделирование тканей в экспериментах после повреждения. Использование как необратимых, так и обратимых моделей обструктивной нефропатии дает исследователям глубокое понимание процессов развития заболевания, а также того, как терапевтические вмешательства модулируют как возникновение повреждения, так и последующее ремоделирование тканей.