Методы Характеризуя совместного развития биопленки и Хабитат неоднородности

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы охарактеризовать взаимодействие биопленки с окружающей средой с помощью интегрированных методов для этого. Сконструирована система микрофлюидных проточных ячеек с двойным входом, в которой глюкозосодержащие и свободные от глюкозы среды перекачиваются через проточную ячейку, создавая градиент глюкозы. Бактерии добавляются в систему, и биопленки развиваются в течение нескольких дней.

Затем биопленки визуализируются с помощью 3D-конфокальной микроскопии, чтобы охарактеризовать транспорт solu. Внутри биопленок флуоресцентные индикаторы вводятся в проточную систему и выполняется покадровая визуализация для характеристики поля потока вокруг колоний биопленки, вводятся флуоресцентные микрогранулы и выполняется покадровая визуализация. Анализ полученных данных с помощью переноса растворенного вещества и отслеживания частиц демонстрирует полезность этого метода для оценки биопленочных процессов в различных химических средах в рамках одного устройства и в одной серии экспериментов.

Основное преимущество этих методов заключается в том, что они позволяют одновременно оценивать множественные аспекты взаимодействия биопленки с окружающей средой. Представленные здесь методы могут помочь ответить на ключевые вопросы об образовании биопленки в естественной среде или при инфекциях, связанных с биопленкой. Работая в колпаке с ламинарным потоком, переведите колонию posa PAO на один конец GFP и колонию кишечной палочки DH на пять альфа из планшета LB на отдельные пробирки, содержащие три миллилитра фунта бульона.

Инкубируйте культуры в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и встряхивайте со скоростью 225 об/мин. Эта проточная система основана на микрофлюидной ячейке с двойным входом, которая облегчает наблюдение за ростом биопленки под четко определенным химическим градиентом, образованным путем смешивания двух растворов в проточной камере. Во время течения образуется плавный градиент концентрации в поперечном направлении.

В результате диффузии профиль концентрации становится крутым вблизи входа и более слабым ниже по потоку. В день эксперимента тщательно соберите проточную систему. Сначала зажмите трубку в перистальтическом насосе, затем присоедините один конец трубки к бутылке со средой, содержащей 900 миллилитров среды FAB с глюкозой, а другой конец к ловушке для мыльных пузырей.

Повторите этот процесс, чтобы подсоединить вторую бутылку со средой, содержащую 900 миллилитров fab без глюкозы, ко второй ловушке для мыльных пузырей. Затем вставьте трехходовые клапаны непосредственно перед входными отверстиями проточной ячейки и подсоедините каждую из пузырьковых ловушек к проточной ячейке. Наконец, подсоедините выходное отверстие проточной ячейки к бутылке для отходов.

Убедитесь, что проточная ячейка расположена скользящей стороной крышки вниз, чтобы подвешенные элементы могли осесть на защитное стекло. После того как проточная система будет собрана, включите перистальтический насос со скоростью расхода 10 миллилитров в час на каждый вход для заполнения системы. Затем, работая в колпаке, разбавьте две бактериальные культуры в соотношении один к одному на один миллилитр стерильной воды с эквивалентным наружным диаметром 600 0,01 для каждой бактерии для инокуляции проточной ячейки, с помощью стерильного пластикового шприца введите 500 микролитров инокулюма в каждое из входных отверстий проточной ячейки через трехходовой клапан.

После инъекции остановите насос и дайте бактериальным клеткам прикрепиться к защитному стеклу в течение одного часа после прикрепления клеток, установите насос на 0,03 миллилитра в минуту для каждого входного отверстия и дайте системе течь в течение трех дней при комнатной температуре, в течение которых биопленка развивается под градиентом воздействия глюкозы. По прошествии трех дней. С помощью маркера и линейки нарисуйте сетку на стороне покровного стекла проточной ячейки при подготовке к визуализации.

Это поможет в определении местоположения областей визуализации для противодействия пятну при просмотре кишечной палочки. Во-первых, выключите свет, чтобы затемнить рабочую зону, так как пятно на счетчике чувствительно к свету. С помощью шприца медленно введите один миллилитр разбавленного красителя красной флуоресцентной нуклеиновой кислоты в трехходовой клапан перед проточной камерой.

Остановите поток. Держите ячейку для потока в застое в темноте в течение 30 минут. По прошествии 30 минут.

Возобновите подачу со скоростью 0,03 миллилитра в минуту и смойте несвязанное пятно в течение 15 минут. Затем остановите поток и наблюдайте за биопленками с помощью конфокальной микроскопии с объективом 63x. Найдите поле зрения, содержащее большое количество биомассы с колониями биопленки, которые хорошо разделены, как показано здесь.

Затем захватите стеки 3D-изображений в соответствующих каналах для отображения пространственных закономерностей развития биопленки в изображении проточной клетки, биопленки на трех или более продольных расстояниях или расстоянии X вдоль входа проточной ячейки и в трех поперечных или Y-положениях относительно наложенного градиента питания. Чтобы охарактеризовать паттерны переноса solu внутри биопленки, начнем с проточной ячейки. После трех дней проявки биопленки, снова работа в темноте.

Остановите насос, чтобы приостановить поток, откройте пузырьковые ловушки, чтобы сбросить давление впрыска. Затем с помощью шприца введите один миллилитр разбавленного раствора научно-фантастического трассера в любой из трехходовых клапанов, расположенных перед проточной ячейкой. После введения научно-фантастического раствора закройте ловушки для мыльных пузырей.

Отрегулируйте трехходовой клапан и перезапустите насос со скоростью 0,03 миллилитра в минуту, чтобы подать научно-фантастическое решение в проточную ячейку. Далее переключите режим конфокальной визуализации на XYT с частотой кадров 0,15 герца. Для вербализации проникновения красителя предпочтительно высокое временное разрешение, однако быстрое сканирование снижает качество изображения.

Поэтому установите скорость сканирования и среднее значение линии, чтобы сбалансировать временное разрешение изображения и качество изображения. После настройки параметров визуализации перезапустите насос, чтобы возобновить поток. Со скоростью 0,03 миллилитра в минуту sci пять будут подаваться в проточную ячейку одновременно.

Инициируйте покадровую конфокальную визуализацию. После завершения цейтраферной съемки. Выполнен диффузионный анализ в соответствии с инструкцией в сопроводительном документе.

Чтобы охарактеризовать поле потока вокруг биопленок, разведите флуоресцентные микрогранулы размером в один микрометр в стерилизованной воде до конечной концентрации твердого вещества 0,2% и конечного объема 0,5 миллилитров. Затем сделайте вихревое действие, чтобы убедиться, что микрогранулы хорошо диспергированы, приостановите поток, а затем введите и доставьте разбавленные флуоресцентные микрогранулы в проточную ячейку. Как и раньше, измените расход на 0,01 миллилитра в час.

Низкая скорость потока позволяет точно отслеживать траекторию движения частиц. Переключите настройки конфокального фокуса в режим XYT и дайте программе команду отслеживать движение частиц в одном Z-срезе. Захватывайте изображения временных рядов, как и раньше, используя частоту кадров в один герц.

Повторите процедуру введения частиц и сделайте изображение в разных точках Z. После завершения визуализации следуйте инструкциям в сопроводительном документе, чтобы рассчитать векторы потока для изучения бактериальных взаимодействий в биопленке под градиентом глюкозы. Posa GFP и E. coli дифференцировали в двухвидовых биопленках путем встречного окрашивания.

С помощью cyto было получено 62 изображения в каждой из девяти областей визуализации на проточной камере. На показанных здесь наложениях posa GFP отображается зеленым или желтым цветом, а кишечная палочка — красным. Поза преобладала в биопленочной биомассе в регионах с высокой концентрацией глюкозы, а в регионах с низкой концентрацией глюкозы преобладала кишечная палочка.

Таким образом, эти два вида занимали разные экологические ниши. Эти результаты демонстрируют полезность микрофлюидной проточной ячейки с двойным входом для изучения активности развития биопленки и взаимодействий в сложных средах. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать микрофлюидную проточную ячейку с двойным входом для выращивания биопленок под химическими градиентами и как получить параметры окружающей среды для развития биопленки с помощью инъекций флуоресцентных частиц или чеканок После проявки.

Эти методы проложили путь исследователям в области экологической и клинической микробиологии к изучению сложных взаимодействий между микробными сообществами и окружающей их средой.