Развитие количественной рекомбиназу полимеразной амплификации с внутреннего положительного контроля

Общая цель данного эксперимента заключается в использовании количественного упрощения рекомбиназной полимеразы для количественной оценки концентрации ДНК в неизвестных образцах. Это достигается путем предварительного добавления в реакцию целевого ДНК внутреннего положительного контроля, ДНК-праймеров и флуоресцентно меченых зондов. В качестве второго шага реакции помещаются в ПЦР-машину в реальном времени, которая нагревает реакции для активации ферментов и контролирует флуоресценцию зондов для обнаружения генерации целевых и управляющих ампликонов.

Затем флуоресцентные данные анализируются с помощью скрипта для создания стандартной кривой и проверки анализа. Результаты показывают, что образцы ДНК могут быть точно количественно определены с точностью до одного порядка от правильной концентрации на основе экспериментов по валидации, используемых для количественного определения ДНК ВИЧ с одной мишенью. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как количественная ПЦР в реальном времени, заключается в том, что РПА является изотермической, поэтому дорогостоящий термоамплификатор не нужен.

RPA также требует более низкой амплификации по температуре, устойчив к загрязненным образцам, усиливает мишень до обнаруживаемого уровня в течение нескольких минут и использует ферменты lly, что обеспечивает легкую транспортировку и хранение при комнатной температуре. Чтобы начать очистку всех поверхностей стола и оборудования раствором 50% отбеливателя, чтобы создать чистое рабочее пространство для предварительного усиления, удалите 280 миллимолярный раствор ацетата магния, буфер для регидратации и реакционные гранулы из морозильной камеры при температуре минус 20 градусов Цельсия и разморозьте растворы при комнатной температуре. Затем соберите мастер-смесь, переложив 383,5 микролитра регидратационного буфера в новую микропробирку из расчета 41,6 микролитра воды, свободной от нуклеазы, в буфер и смешайте 35 микролитров ацетата магния в отдельную пробирку.

Верните ацетат магния в буферных растворах для регидратации в морозильную камеру. Затем получите грунтовку и проб квас из холодильника с температурой четыре градуса Цельсия. Поместите их в рабочее пространство для предварительного усиления и выключите свет, чтобы свести к минимуму воздействие света на уровне 27,3 микролитров каждого из 10 микромолярных прямых и обратных праймеров в мастер-микс.

Далее в 7,8 мкл 10 микромолярного гекса мечили HIV 1D NA. Щупом в мастер-микс и закрутите трубку. Затем верните праймер и исходные растворы зонда на хранение реагентов для внутреннего положительного контроля могут быть добавлены сюда, как указано в текстовом протоколе, для сборки реакций QRPA. Сначала поместите сублимированные ферментные гранулы в отдельные пробирки по две низко расположенные восьмилуночные полоски для ПЦР пипетки 37,5 микролитров мастер-смеси в пробирку, содержащую гранулы.

Аккуратно перемешайте содержимое пробирки с помощью наконечника пипетки, чтобы растворить гранулу без образования пузырьков. Осторожно извлеките наконечник из реакции, чтобы не допустить потери объема и не заменять наконечники пипеток между каждой пробиркой. Переложите трубки в охлажденный 96-луночный холодный блок не менее чем на пять минут, чтобы охладить мастер-микс.

Тем временем загрузите программное обеспечение термоамплификатора с протоколом и расположение пластины указано в текстовом протоколе. Затем отрежьте две полоски прозрачного пластика Micro Seal Adhesive так, чтобы они были немного шире пробирок для ПЦР. А также получить две плоские крышки полоски для ПЦР-пробирки, аликвотировать на ВИЧ один шаблон плазмиды, как указано в текстовом протоколе.

А затем добавить 10 микролитров шаблона в соответствующую ПЦР-пробирку. Снова аккуратно перемешайте смесь кончиком пипетки. Затем добавьте по 2,5 микролитра ацетата магния в каждую крышку пробирки, а затем аккуратно поместите крышки поверх реакционных пробирок так, чтобы они не были полностью закрыты.

Ацетат магния должен быть хорошо виден через колпачок. Поместите полоски для ПЦР-пробирок в микроцентрифугу и центрифугируйте пробирки в течение 10 секунд, чтобы собрать всю жидкость на дне пробирки и удалить любые пузырьки. Соединение раствора ацетата магния с исходной смесью инициирует реакцию QRPA.

Быстро извлеките пробирки ПЦР в холодный блок, чтобы остановить реакцию. Затем медленно снимите крышки, чтобы предотвратить загрязнение реакций, и запечатайте пробирки прозрачной пленкой Micros Seal. Перенесите трубки в термоамплификатор в соответствии с местами в схеме расположения пластин.

Закройте крышку термоамплификатора и нажмите кнопку «Запустить работу». Обязательно укажите имя файла для эксперимента после его завершения. Просмотрите необработанные данные флуоресценции и экспортируйте их в электронную таблицу, которая создаст файл под названием «Результаты количественного усиления».

Построить стандартную кривую. Сначала скачайте стандартный скрипт кривой, затем откройте MATLAB или аналогичную программу анализа данных. Откройте сценарий и нажмите кнопку «Выполнить», чтобы запустить сценарий.

Введите количество файлов данных, которые будут проанализированы при появлении запроса. Затем введите количество выборок и количество реплик в каждом обучающем файле. В командном окне.

Введите самую низкую концентрацию ДНК в логарифмических 10 копиях, которые использовались для построения стандартной кривой, и нажмите Enter. В примере здесь. Самая низкая концентрация – одно бревно из расчета 10 экземпляров.

Затем введите разницу в концентрации между каждым стандартом ДНК в командную строку и нажмите Enter здесь. Интервал концентрации составляет один логарифм из 10 экземпляров. Затем введите значение порога уклона в командное окно и нажмите клавишу Enter.

Это значение обычно находится в диапазоне от трех до пяти. Введите число стандартных отклонений над фоном для положительного порога, также известного как Z, а затем нажмите Enter Типичные значения Z в диапазоне от одного до пяти. Далее укажите оборудование, которое использовалось для сбора данных в данном случае.

Введите один для термоамплификатора и нажмите Enter. Если имеется внутренний положительный контроль, выберите значение по умолчанию или новое значение порога, введя Y или N в зависимости от того, требуется ли новый порог. Наконец, выберите все файлы электронных таблиц, которые будут использоваться для построения стандартной кривой.

После этого скрипт автоматически импортирует и проанализирует все данные. QRPA в реальном времени проводили на дубликатах образцов, содержащих различные числа копий 1D NA ВИЧ. Начало детектируемой амплификации, на что указывает увеличение флуоресценции, происходит раньше для образцов с более высоким числом копий ДНК, чем для образцов с меньшим числом копий. Исходные флуоресцентные данные были использованы для построения стандартной кривой на основе амплификации известных концентраций 1D NA ВИЧ. Эти данные были подогнаны к экспоненциальной кривой, а значение R в квадрате указывает на высокую степень соответствия.

Стандартная кривая использовалась для прогнозирования концентраций дополнительных образцов ДНК известной концентрации. Корректировка значения Z до единицы позволяет точно прогнозировать низкие концентрации ДНК. Напротив, высокие концентрации ДНК лучше прогнозируются при значении Z, равном пяти.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что у RPA отсутствуют истинные циклы, ограничивающие скорость амплификации ДНК. Таким образом, скорость усиления должна точно контролироваться. Согласованность между экспериментами имеет решающее значение, поэтому обязательно используйте одни и те же аликвоты праймера для всех экспериментов.

Защищайте компоненты реакции от нагрева и света. Добавьте ацетат магния непосредственно перед началом сбора данных и сохраняйте реакции в холодном блоке до начала. Эксперимент.