Lepr

Общая цель данной процедуры заключается в получении жизнеспособных островков из поджелудочной железы диабетических мышей LEP R DB и оценке секреции инсулина бета-клетками внутри этих островков с помощью двухфотонной визуализации живых клеток. Для этого сначала подготавливаются такие реагенты, как смесь ферментов для переваривания поджелудочной железы, культуральная среда для культивирования островков и внеклеточный буфер для двухфотонного анализа. Затем вскрывается брюшная полость эвтаназированной мыши, и в поджелудочную железу вводится смесь ферментов для дигестии органа.

Затем илеты отделяют от панкреатического дигестата и культивируют. В завершение с помощью двухфотонной микроскопии визуализируют слияние отдельных гранул инсулина в бета-клетках внутри илета. В конечном итоге данный протокол поможет исследователям понять механизмы регуляции секреции инсулина при норме и патологии.

Основным усовершенствованием метода изоляции островков является использование смеси ферментов для повышения выхода и жизнеспособности островков. Метод двухфотонной визуализации в настоящее время является единственным способом регистрации секреции инсулина из нескольких клеток внутри целого островка. Для приготовления ферментов для изоляции островков поджелудочной железы разведите один флакон лиазы TL массой 5 mg в 26 ml DM EM; приготовьте коллагеназу 4-го типа в буфере Хэнкса до концентрации 0,5 mg/ml, добавив следующие смешанные растворы лиазы TL и коллагеназы.

Разделите смесь ферментов на аликвоты по 2,5 миллилитра в соотношении четыре к одному по объему и храните при температуре -20 °C. Для приготовления среды для изоляции RPMI в большом коническом флаконе с одним литром воды растворите при комнатной температуре один флакон порошка RPMI 1 6 4 0, добавьте два грамма бикарбоната натрия и 4,02 грамма HEPES. Используйте гидроксид натрия для доведения pH до 7,4, затем профильтруйте для стерилизации и храните при температуре 4 °C.

Приготовьте культуральную среду RPMI, добавив 10% FBS и 1% антибиотиков в среду RPMI для изоляции, используемую для двухфотонной визуализации. Приготовьте богатый натрием внеклеточный буфер с использованием следующих реагентов. Для приготовления внеклеточного красителя создайте 8 мM стоковый раствор SRB во внеклеточном буфере, разлейте по небольшим пробиркам и храните при -20 °C.

Для получения рабочей концентрации разведите исходный раствор SRB в 10 раз, используя свежий внеклеточный буфер. После того как мышь была умерщвлена и ее тело было тщательно обработано 70% ethanol в соответствии с текстовым протоколом, расположите животное головой к хирургу, а хвостом — от него. Сделайте два длинных латеральных разреза кожи брюшной полости и брюшины, чтобы сформировать лоскут в форме буквы V.

Отодвиньте кожный лоскут вверх, чтобы полностью обнажить брюшную полость. Отодвиньте петли кишечника в сторону и, используя сложенную ткань, зафиксируйте печень, чтобы открыть общий желчный проток. Затем наложите сосудистый зажим на ампулу в стенке двенадцатиперстной кишки, чтобы предотвратить попадание введенных ферментов в двенадцатиперстную кишку.

Это важный этап, который определяет, поступят ли ферменты поджелудочной железы в рефлюкс панкреатического протока, в место инъекции или в двенадцатиперстную кишку. Используйте иглу 31-го калибра для канюлирования общего желчного протока рядом с местом слияния общего печеночного и пузырного протоков, оставив место для второй инъекции. Если перфузия поджелудочной железы не удалась с первого раза, медленно введите около 2 мл холодной смеси ферментов в общий желчный проток мыши.

Если зажим установлен правильно, перфузия поджелудочной железы будет проведена быстро. После завершения перфузии быстро извлеките орган, поместите его в стеклянный флакон и инкубируйте в водяной бане при 37 °C в течение примерно 19 минут. После инкубации остановите процесс переваривания, добавив примерно 20 milliliters холодного изолирующего раствора.

Осторожно встряхните пробирку, чтобы разрушить ткань поджелудочной железы, и процедите содержимое через обычное сито с размером пор 1 мм в стерильную пробирку объемом 50 мл. Долейте в пробирку среду для выделения и центрифугируйте при 400 G и 4 °C в течение одной минуты. После остановки центрифуги добавьте среду для выделения к осадку и растворите его.

Затем перенесите суспензию в две пробирки объемом 15 миллилитров и центрифугируйте повторно. После аспирации супернатанта добавьте по шесть миллилитров среды для разделения клеток методом градиента плотности в каждую пробирку, затем ресуспендируйте содержимое с помощью дозатора или вортекса. Затем, аккуратно прислонив пробирки к стенкам, добавьте примерно шесть миллилитров изолирующей среды поверх среды для разделения по градиенту плотности и центрифугируйте при 100 G и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут.

После разделения соберите верхний, средний и нижний слои в три отдельные чашки. Затем под диссекционным микроскопом с помощью пипетки вручную выберите глазки из трех чашек. Большая часть глазков будет находиться в среднем слое, что поможет им восстановиться после ферментативного переваривания.

Подготовьте группы по 40 островков в чашках Петри диаметром 25 сантиметров с шестью миллилитрами культуральной среды RPMI, содержащей 10 миллимоляр глюкозы, и культивируйте их в течение двух дней. Ежедневно меняйте среду для проведения двухфотонной визуализации в качестве косвенного метода измерения секреции инсулина. Начните с использования внеклеточного буфера с тремя миллимоляр глюкозы для предварительной инкубации островков, культивируемых в течение двух дней.

В течение 30 минут наносите вазелин на предметный столик микроскопа для предотвращения утечки раствора, затем установите на столик термостатную камеру, содержащую предметное стекло. Затем заполните камеру 500 µL внеклеточного буфера, содержащего 0,8 mM SRB и глюкозу в различных концентрациях. Далее поместите предварительно инкубированный глазной диск в центр камеры и сфокусируйтесь на уровне трех-четырех клеточных слоев внутри диска.

При иммуногистохимическом окрашивании на инсулин в островках грызунов видно, что большинство клеток являются бета-клетками. Затем с помощью двухфотонного микроскопа и иммерсионного масляного объектива 60x идентифицируйте отдельные акты экзоцитоза по внезапному появлению маленького флуоресцентного пятна. Наконец, в программном обеспечении для анализа сканированных изображений подтвердите событие по фазе быстрого нарастания флуоресцентного сигнала в области интереса для мыши дикого типа.

Ожидается получение около 200 островков при использовании протокола, продемонстрированного в данном видео. Здоровые островки выглядят яркими, имеют округлую форму и гладкие края. В случае недостаточной перевариваемости в группе выделения обычно присутствуют мелкие, размытые островки, а также островки с прикрепленными к ним клетками.

В то время как в перетравленной партии при двухфотонном анализе в ответ на такие стимулы, как глюкоза или высокий уровень калия, наблюдается меньше «глазков», когда инсулиновые гранулы сливаются с плазматической мембраной, SRB проникает в гранулы, что приводит к появлению внезапного флуоресцентного пятна диаметром примерно 400 нанометров. За время записи идентифицируются все экзоцитозные события в ответ на стимул, а также определяются локализация событий, время их появления, продолжительность и тип слияния. Такие события, как «поцелуй и разрыв» (KISS and Run) или полное слияние, характеризуются и являются ценными для оценки любых дефектов слияния гранул в моделях диабета 2-го типа.

Этот метод был использован, чтобы показать, что дефект в островках поджелудочной железы диабетических мышей DB DB заключается в потере полного слияния гранул, а не в изменении кинетики слияния отдельных гранул. Кроме того, наиболее значимым фактором, влияющим на снижение секреции инсулина при заболевании, является уменьшение количества функционально активных клеток. После просмотра этого видео вы должны хорошо разобраться в процедурах перфузии поджелудочной железы и активации островков из поджелудочной железы мышей RDB, а также научиться проводить два типа анализа для оценки секреторных ответов внутри интактных островков.