Mammosphere Формирование анализа из рака молочной железы человека тканях и клеточных линий

Анализы плавающей маммосферы могут исследовать подмножество стволовых клеток рака молочной железы, которые выживают в условиях суспензии и демонстрируют усиленный онкогенез при имплантации мышам. Этот протокол обеспечивает удобную in vitro меру сферообразующей способности, прокси для онкогенеза in vivo, в то же время облегчая анализ транскрипционного ландшафта, связанного со стволом.

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы оценить долю стволовых клеток в раковой клеточной линии или образце опухолевой ткани, а также оценить их способность к самообновлению в течение последующих пассажей. Для этого линия раковых клеток или опухолевая ткань обрабатываются для получения одиночной клеточной суспензии, которая затем сортируется для выделения CD 44 положительных и CD 24 отрицательных клеточных субпопуляций. Клетки высевают на низкие прикрепленные пластины, дают время для роста, а затем исследуют с помощью световой микроскопии.

Эффективность формования количественно определяется путем определения числа образовавшихся сфер по отношению к числу первоначально засеянных ячеек. Процесс генерации суспензии одной клетки, дающий время для роста и определяющий эффективность формирования сфер, повторяется в течение последовательных проходов, в конечном итоге обеспечивая меру способности клеток к самообновлению с течением времени. Этот метод обеспечивает простой перспективный анализ для идентификации клеток, проявляющих функциональные свойства стволовых клеток, такие как самообновление, а также количественную оценку количества стволовых клеток, происходящих из опухолей in vivo.

Центральный принцип анализов на формирование сфер заключается в том, что каждая сфера получается из одной клетки, которая существует для клонирования. По этим причинам плотность клеток является наиболее важным параметром данного анализа, поскольку она оказывает решающее влияние на работу под стерильным культуральным колпаком. Начните эту процедуру с MCF 7 или MDA MB 2 3 1 клеток, которые имеют 70-80% кофлюентности.

Отсадите среду из колбы, дважды промойте клетки PBS. Затем добавьте трипсин ЭДТА и инкубируйте в течение двух-шести минут после отсоединения лебедки, добавив в сферу маммо, содержащую 10% FBS. Как только ячейки отсоединены, перенесите их в коническую центрифужную трубку объемом 15 миллилитров и вращайте ее в 200 раз больше G при комнатной температуре в течение пяти минут.

После центрифугирования сцедите сенну. Затем суспензируйте клетки в одном-пяти миллилитрах маносферной среды, пипетируйте вверх и вниз 10 раз, чтобы разрушить клеточную гранулу. Затем пропустите клеточную суспензию к 40-микронному фильтру для тренировочной крышки клетки и соберите поток через прилагаемую пробирку.

Чтобы получить суспензию одиночных клеток, я помещаю 20 микролитров аликвоты ресуспендированных клеток на гемоцитометр и исследую ее с помощью микроскопа. Если скопления клеток наблюдаются так, как показано здесь, используйте шприц, чтобы вмассировать суспензию внутрь и из иглы 25 калибра один или два раза. После того, как клетки диспергируются в одноклеточную суспензию, как показано здесь, их удаляют для выделения CD 44 положительных CD 24 отрицательных клеточных субпопуляций с помощью флуоресцентно активированных клеточных источников или магнитно-активированных клеток.

Используйте столбец LS для положительного выбора CD 44 положительных клеток. Так как нужные ячейки прикрепляются к стенкам колонки ЛС, отбрасывают сквозной поток, после чего удаляют ячейки из колонки. Нанесите пять миллилитров буфера, а затем надавите на поршень, входящий в комплект колонны, чтобы промыть нужные ячейки.

Затем используйте столбец LD для дальнейшего очищения популяции путем отрицательного отбора. Здесь CD 24 положительные клетки прикрепляются к столбцам LD. Соберите поток, через который содержатся CD 24 отрицательные клетки.

Далее с помощью проточной цитометрии подтверждают фенотипы всех выделенных клеток. Используя метод исключения триановского синего, рассчитайте плотность жизнеспособных клеток после соответствующего разбавления клеточной суспензии. Засейте каждую лунку из шести лунок сверхнизкой присадочной пластины с 500-4000 квадратными клетками в два миллилитра полной маммосферы. Терпимая.

Инкубируйте пластины, стараясь не тревожить их в течение пяти-десяти дней, пока не появятся сферы. Продолжайте культивирование до тех пор, пока сферы не достигнут диаметра не менее 40 микрон, но еще не начнут поворачиваться. Апоптотический. Получить ткань рака молочной железы человека от пациенток, перенесших операцию по удалению опухолей молочной железы.

Храните салфетку на льду до 24 часов в объеме 50 миллилитров. Стерильные пробирки в DMEM содержат 100 единиц на миллилитр, пенициллин и 100 единиц на миллилитр. Стрептомицин работает под стерильным тканевым культуральным колпаком.

Перенесите образец в 100-миллиметровую чашку для культуры тканей, содержащую небольшой объем среды, с помощью стерильных ножниц, скальпеля и пинцета. Удалите жировую ткань. Добавьте два-три миллилитра D-M-E-M-F 12 и с помощью стерильного скальпеля или бритвенного лезвия измельчите образец, пока не останется крупных кусочков.

Риз сгибает кусочки ткани и 10 миллилитров предварительно подогретого DMEM, содержащего протеолитические ферменты и инкубируется при температуре 37 градусов Цельсия во вращающемся вибростенде в течение одного-трех часов. При накоплении жизнеспособных опухолевых клеток приматов с помощью пищеварительных ферментов возникает критический компромисс между гибелью клеток и достаточным извлечением из клеточного матрикса внутрь. Убедитесь, что успех имеет важное значение для регулярного контроля этого пищеварения. Каждые полчаса пипетируйте 20 микролитров суспензии на гемоцитометр и используйте микроскоп для оценки степени пищеварения.

Как только пищеварение будет завершено. Дайте осколкам отстояться в течение пяти минут. Затем переложите супинат в коническую полипропиленовую трубку объемом 15 миллилитров

Центрифугируйте в 200 раз больше G в течение 10 минут при комнатной температуре. После отжима осторожно сцедите лежачий на спине агент и ресуспендируйте клетки в одном-пяти миллилитрах маммосферной среды. Затем приготовьте и планшетируйте одноклеточные суспензии, как описано в предыдущем разделе.

В этом видео попросите клетки вверх и вниз через шприц 25 калибра не более двух раз, чтобы при необходимости рассеять клетки. После периода культивирования наблюдайте за клетками при 40-кратном увеличении под микроскопом, оснащенным цифровой камерой. Приобретайте изображения пяти случайных полей.

После того, как все изображения будут сделаны, используйте программное обеспечение для сбора данных, чтобы определить количество микросфер диаметром более 40 микрон. Наконец, рассчитайте эффективность формирования метасферы. Разделив количество сфер мамоса в каждой лунке на количество клеток, засеянных в каждой лунке, умноженное на 100, я ставлю среду, содержащую сферы мамоса из каждой лунки, в 15-миллилитровую пробирку. Промойте каждую лунку PBS и добавьте ее в собранную среду.

Затем центрифугируйте клетки при 115-кратном G в течение 10 минут при комнатной температуре. После спина отбросьте супинатные андрии. Суспензируйте гранулы в 500 микролитрах предварительно подогретых триин ЭДТА, выдержите две-три минуты.

После инкубации добавьте 500 микролитров FBS для нейтрализации триина, затем центрифугируйте при 500-кратном перегрузке в течение пяти минут. Как только вращение будет завершено, выбросьте супинат и там закрутите шарик в 100 микролитрах маммосферы, средней пипеткой вверх и вниз, чтобы разложить любые сферы. Опять же, с помощью гемоцитометра, подсчитывают клетки и определяют, диспергировались ли они в одноклеточную суспензию.

Если нет, пропустите их через шприц 25 калибра до двух раз, чтобы получить одиночные клетки, засейте клетки в новую ультранизкую клетку. Насадка шесть, скважинная пластина с той же плотностью, которая используется в первичной генерации, через 5-10 дней подсчитывает сферы размером более 40 микрон и рассчитывает эффективность формирования страха, как и раньше, для оценки эффективности формирования сфер. Атмосферы были выращены из эпителиального эстрогена-положительного CF 7 и мезенхимального трижды отрицательного MDA 2 3 1 клеточной линии, как описано в этом видео, подсчет маммосферных сфер размером более 40 микрон дает оценку эффективности формирования сфер для каждой клеточной линии.

Обратите внимание, что наблюдаемая здесь минимальная агрегация слияния ячеек была достигнута за счет покрытия с низкой плотностью на 500 клеток на квадратный сантиметр для MCF 7 и 1000 клеток на квадратный сантиметр для MDA 2 3 1. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выращивать и подсчитывать маммосферы, полученные из различных клеточных линий или из образцов хирургических опухолей. При попытке проведения этой процедуры важно помнить о посеве клеток с низкой плотностью, чтобы обеспечить клональность и обеспечить жизнеспособность высокой доли клеток при извлечении клеток из хирургических образцов.

В дополнение к этой процедуре должны быть выполнены другие методы, такие как популяции клеток ксенотрансплантата у мышей с ослабленным иммунитетом, чтобы определить in vivo генность опухоли представляющих интерес тканей.