Экспериментальная Демиелинизация и ремиелинизацию мышиной спинного мозга Focal инъекций лизолецитина

Общей целью этой процедуры является изучение аспектов демиелинизации и последующей ремиелинизации в спинном мозге мыши. Это достигается путем предварительного введения моющего средства лиин из вытянутого стеклянного капилляра в вентральное белое вещество спинного мозга. Затем спинной мозг обрабатывается в разные моменты времени для изучения аспектов восстановления, включая набор клеток-предшественников олигодендроцитов, дифференцировку и ремиелинизацию.

Этот метод полезен не только для изучения нормальных событий, связанных с ремиелинизацией, но и в качестве доклинического инструмента для скрининга ремиелинизации, способствующей терапии. Начните с снятия аликвоты 75 микролитров 1%-ного раствора моющего средства с минус 20 градусов Цельсия, храните и разморозьте до комнатной температуры на скамейке, если моющее средство не растворилось. Обрабатывайте трубку ультразвуком при частоте 40 килогерц в течение примерно 30 минут, чтобы получить однородный раствор.

Затем открутите гайку шприца для инъекций объемом 10 микролитров и наденьте его на плоский конец стеклянного капилляра PrepU. Добавьте два варианта и убедитесь, что их эндиг плотно прилегает к капилляру. Теперь промойте шприц изопропанолом и снимите поршень.

После высыхания рукой затяните узел иглы на шприце для инъекций. Затем прикрепите к грунтовочному шприцу металлическую иглу ступицы. Проткните иглой резиновый диск и сдвиньте его вниз к основанию.

Теперь наполните грунтовочный шприц лио комнатной температуры, чем моющее средство. Осторожно нажмите на поршень, чтобы удалить нежелательный воздух, пока раствор не станет виден на кончике иглы для контрольных операций. Загрузка PBS.

Теперь вставьте металлическую иглу ступицы грунтовочного шприца в инъекционный шприц, убедившись, что резиновый диск плотно прилегает. Затем медленно надавите на грунтовочный шприц до тех пор, пока капилляр не заполнится до кончика раствором. При заполненном капилляре осторожно вытащите грунтовочный шприц, продолжая при этом заполнять цилиндр инъекционного шприца.

Старайтесь избегать попадания пузырьков воздуха. Теперь вставьте поршень в инъекционный шприц и убедитесь, что раствор будет вытекать с наконечника. Если в капиллярном или инъекционном шприце видны пузырьки воздуха, повторите подготовку шприца с самого начала.

Непрерывная подача жидкости в инжекционный аппарат имеет решающее значение для обеспечения точных объемов впрыска. В завершение прикрепите инъекционный шприц к руке стереотаксического микроманипулятора. Эта установка может вводить от 15 до 20 животных, прежде чем потребуется новый капилляр.

Сначала обезболите животное, в данном случае молодую взрослую самку, С 57 черной шестеркой мыши. Используйте кетамин и ксилазин и запланируйте часовую анестезию. Обеспечьте адекватную седацию в зависимости от отсутствия реакции на сильное защемление ноги.

Затем выбрейте двух-трехсантиметровый квадратный участок со спинной стороны ближе к ушам. Протрите кожу 70%-ным этанолом на марлевой салфетке, удалив все волосы. Затем продезинфицируйте участок йодом.

Обязательно нанесите мазь атома и держите животное в отапливаемой камере восстановления. Готовы приступить к процедуре. Переместите животное в стереотаксическую раму спинной стороной вверх, приподнятой в средней части с помощью сложенных бумажных полотенец, чтобы преувеличить искривление позвоночника.

Затем закрепите голову зубчатым зажимом и закрепите руки и хвост хирургическим скотчем. Стабилизирующие ушные планки не нужны. Теперь с помощью скальпеля сделайте трехсантиметровый разрез по средней линии, начиная чуть ниже ушей и разрезая в направлении объятий.

Затем найдите разрыв между двумя большими жировыми структурами и используйте тонкие щипцы в каждой руке. Чтобы раздвинуть их, раздвиньте ретракторы, чтобы открыть операционное поле под хирургическим микроскопом, найдите выступающий костный вырост позвонка Т-2, характерный для линии мышей C 57 black six. Чтобы рассмотреть позвонок, сделайте тупое рассечение перекрывающей мускулатуры закрытыми пружинными ножницами.

Затем нащупайте твердые поверхности Т 3 и Т 4, чтобы подтвердить правильное анатомическое положение. Теперь сделайте неглубокие боковые надрезы в соединительной ткани между Т-3 и Т-4. Имейте в виду, что слишком глубокий порез может проколоть и повредить шнур.

Некоторые кровотечения являются обычным явлением и могут быть устранены с помощью губчатого копья. Спинной мозг покрыт толстым слоем твердой мозговой оболочки и будет виден, если этот менингеальный слой еще не был разрезан. Если твердая мозговая оболочка осталась неповрежденной, осторожно удалите ее с помощью легких боковых царапин металлической иглой 32 калибра.

Избегайте прокалывания оставшихся нижних мозговых оболочек, которые не такие толстые и их труднее увидеть. Если из паутинной оболочки вытекает спинномозговая жидкость, удалите ее с помощью губчатого копья. Начните инъекцию с перемещения капилляра в положение над спинным мозгом.

Выступающий ростральный кровеносный сосуд не следует использовать в качестве ориентира по средней линии. Вместо этого используйте границы серого белого вещества, фланкирующие дорсальную колонну, чтобы оценить среднюю линию. Теперь медленно опускайте капилляр до тех пор, пока его кончик едва коснется спинного мозга непосредственно по обе стороны от средней линии.

Зафиксируйте руку на месте в этом положении. Затем запишите исходное положение на градуированных измерениях направления Z на стереотаксическом плече. Из этого показания отнимите 1,3 миллиметра и быстрым и неглубоким движением вниз прокалывайте ткань, осторожно опуская капилляр на нужную глубину.

Теперь с помощью микроманипулятора делайте один полный оборот каждые пять секунд в течение двух минут, чтобы ввести общий объем 0,5 микролитра. Затем оставьте капилляр на месте на две минуты. Через две минуты осторожно оттяните капилляр от ткани.

Это позволяет раствору проникнуть внутрь. В противном случае он может отодвинуть инъекционный аппарат от животного и удалить втягивающие устройства. Закройте животное, завязав один шов в мышечной жировой ткани, перекрывающий позвоночный столб.

Затем используйте непрерывный шов, чтобы закрыть кожу и нанести больше йода на место разреза. В завершение поместите животное в нагретую камеру восстановления, пока оно не придет в себя, а затем верните его в клетку. Послеоперационный уход и анализ описаны в текстовом протоколе: фокальная инъекция лайина в вентральное белое вещество.

Образуется дискретное демиелинизирующее поражение, которое охватывает примерно три миллиметра. Проводили иммуногистохимическое окрашивание очага поражения с мечением миелина ПМК и мечение аксонов SM I three 12. Аксоны были лишены миелина через семь дней, а через 14 дней положительные кольца ПМК окружили многие аксоны, что свидетельствует о том, что происходит ремиелинизация.

Окрашивание клеток линии олигодендроцитов с использованием PDG FFR альфа LIC two и CC 1 показало значительное увеличение как общего количества клеток через 14 дней по сравнению с семью днями, так и большее распределение зрелых олигодендроцитов по сравнению с OPC. В соответствии с этим открытием, полутонкие срезы, окрашенные толуидином, синим цветом показали наличие тонких миелиновых листов через 14 дней, которые редко обнаруживались через семь дней. Указание на наличие ремиелината междоузлий при владении языком.

Операция может быть выполнена за 10-15 минут для каждого животного, в частности, с помощью второго человека, накладывающего швы.