Измерение максимальной Изометрические усилие, создаваемое проницаемыми скелетных мышечных волокон

Общая цель этой процедуры заключается в измерении максимальной изометрической способности отдельных волокон к генерации силы из образцов скелетных мышц с химической проницаемостью. Это достигается путем предварительного воздействия на мембраны мышечных волокон химического детергента, тем самым удаляя барьер между внеклеточным и внутриклеточным содержимым. Второй шаг заключается в извлечении отдельного волокна из небольшого пучка волокон и прикреплении его к экспериментальному аппарату.

Затем с помощью лазерных интерференционных диаграмм устанавливается оптимальная длина саркомера для отдельного волокна. Наконец, вводится кальций, чтобы вызвать максимальную силу изометрического сокращения. В конечном счете, метод перме с одним волокном обеспечивает оценку сократительных свойств скелетных мышц без сложностей, связанных с архитектурой всей мышцы.

Визуальная демонстрация этого метода полезна, так как ключевые шаги для успешного выполнения протокола могут быть сложными для изучения. Начните с подготовки решений для препарирования, хранения и тестирования, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Далее с помощью щипцов изготовьте шовные петли из нитей нейлонового шовного материала USP 10 с нулевым монофиламентом.

Используя технику двойного узла сверху, подготовьте четыре петли для каждого тестируемого волокна. После формирования поместите узел под микроскоп и уменьшите его размер примерно до 750 микрометров в диаметре. Использование маркировки IPS GTI в качестве ориентира.

Затем обрежьте лишний шов, оставив только петлю и небольшие 500 микрометровые хвостики с обеих сторон. Перенесите небольшую массу мышечной ткани, полученную с помощью открытой или игольчатой биопсии, в чашку с охлажденным раствором для вскрытия и добавьте еще раствор для диссекции, чтобы убедиться, что ткань остается погруженной. Осмотрите образец под микроскопом и с помощью манипуляций выровняйте продольную ось волокон по направлению к правому плечу исследователя.

Затем закрепите образец на чашке, прикрепив его по углам щипцами в левой руке и ножницами для микропрепарирования в правой. Начните аккуратно рассекать пучок по продольным краям между волокнами. Удалите и выбросьте все ткани, поврежденные щипцами или штифтами.

В результате процесса препарирования переложите пучки из рассекающего раствора в трехмиллилитровый флакон, содержащий 2,5 миллилитра свежего охлажденного раствора для препарирования с добавлением неионогенного моющего средства. Инкубируйте образец на льду в течение 30 минут, время от времени осторожно перемешивая, и следите за тем, чтобы пучки оставались погруженными в воду на протяжении всей инкубации. Затем переложите пучки во флакон со свежим раствором для препарирования и осторожно и кратковременно перемешайте, чтобы удалить остатки моющего средства.

После промывки переложите связки во флакон с охлажденным раствором для хранения и инкубируйте в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день достаньте флакон из хранилища при температуре четыре градуса Цельсия и переложите все свертки в аптечку или посуду для препарирования. При подготовке к хранению переложите пачки в криопробирки с индивидуальной маркировкой, наполненные от 200 до 400 микролитрами свежего раствора для хранения, и следите за тем, чтобы пачка не прилипла к боковой стороне пробирки и не плавала на поверхности.

Затем закройте пробирку крышкой и храните образец при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Установите экспериментальный аппарат, подобный показанному здесь и указанному в сопроводительном текстовом протоколе. Затем заполните первую экспериментальную камеру расслабляющим раствором, вторую камеру – раствором для предварительной реактивации, а третью – раствором для активации.

Отрегулируйте температуру в камере до тех пор, пока она не станет стабильной на уровне 15 градусов Цельсия, с помощью аппарата в расслабляющем растворе. Наденьте две подготовленные шовные петли на крепежные поверхности из нержавеющей стали, идущие как от преобразователя силы, так и от регулятора длины. Затем разморозьте интересующий вас пучок волокон на льду в течение примерно 15 минут, а затем переложите его в чашку Петри, покрытую силиконовым эластомером, наполненную свежим охлажденным расслабляющим раствором.

Закрепите пучок на месте булавками с обоих концов и убедитесь, что он погружен в воду с помощью щипцов. Возьмитесь за волокно одним концом и начните плавно извлекать его вдоль его продольной оси. Следует соблюдать осторожность при извлечении волокон из пучка, так как спайки между волокнами и внеклеточным матриксом могут привести к чрезмерному натяжению, что в конечном итоге приведет к повреждению, вызванному растяжением.

После извлечения введите волокно в модифицированный наконечник пипетки вместе с небольшим количеством расслабляющего раствора и перенесите его в экспериментальную камеру, которая содержит расслабляющий раствор, мягко направляя щипцами. Снимите волокно с наконечника пипетки и закрепите его на регуляторе длины. Используя первую шовную петлю, манипулируйте другим концом волокна по направлению к преобразователю силы и закрепите волокно, используя ту же процедуру.

Удалите излишки швов с помощью микроножниц. Затем наденьте вторую петлю на первую и закрепите волокно в точке в пределах 0,2 миллиметра от конца поверхности крепления регулятора длины. Повторите то же самое со второй петлей на конце датчика силы волокна.

Отрегулируйте положение регулятора длины в направлении оси Y для того, чтобы выровнять волокно параллельно боковым стенкам экспериментальной камеры. Затем обследуйте волокно с помощью призматического вида сбоку и отрегулируйте положение регулятора длины в направлении оси Z до тех пор, пока волокно не станет параллельным полу камеры. Если волокно каким-либо образом повреждено, его следует выбросить и присоединить новое волокно.

Включите лазер и отрегулируйте положение предметного столика таким образом, чтобы лазер проходил через центр волокна. Затем установите длину саркомера, увеличивая или уменьшая натяжение волокна с помощью микрометра по оси X контроллера длины до тех пор, пока на целевом экране не будет наблюдаться желаемое расстояние между дифрагированным светом. После того, как оптимальная длина саркомера установлена, измерьте расстояние между двумя самыми внутренними швами.

Расположите камеру таким образом, чтобы вертикальное перекрестие окуляра было выровнено по внутренней границе одного внутреннего шва и нуля. Цифровое считывание на микрометрическом приводе перемещает предметный столик по оси x относительно микроскопа до тех пор, пока вертикальное перекрестие окуляра не совпадет с самым внутренним швом. Цифровой дисплей будет показывать длину волокна, поддерживать его на измеренной длине и использовать камеру, установленную на микроскопе, для получения изображения центральной части волокна с большим увеличением как сверху, так и сбоку.

Используйте эти изображения для расчета площади поперечного сечения волокна. С помощью программного обеспечения для управления камерой переместите волокно в камеру, содержащую раствор для предварительной реактивации, и инкубируйте там в течение трех минут. Пока волокно инактивирует раствор, измерьте его пассивное натяжение, затем переместите волокно в камеру, содержащую активирующий раствор, и позвольте развиться максимальной изометрической силе, о чем свидетельствует плато в силе, которому предшествует быстрый подъем.

Затем используйте регулятор длины, чтобы применить большое быстрое и кратковременное уменьшение расстояния между точками крепления волокна с последующим быстрым возвратом к исходной длине для определения выхода преобразователя силы, соответствующего нулю. Показанная здесь сила является как верхним, так и боковым видом волокна эллиптической формы с этих видов. Площадь поперечного сечения определяли путем измерения диаметров в пяти точках по длине волокна и последующего вычисления среднего значения пяти полученных площадей.

Силовые следы от человеческих, медленных и быстрых мышечных волокон иллюстрируют, что быстрые волокна генерируют силу с большей скоростью, чем медленные волокна, используя технику, показанную в этом видео. Были измерены типичные характеристики мышечных волокон мышей человека и крысы, которые представлены здесь. Показанный диапазон указывает на 25-75-й квартили, а N — на количество протестированных волокон.

Обратите внимание на большие различия в удельной силе у разных видов. Описанные здесь процедуры приводят к оценке максимальной способности одного скелетного мышечного волокна генерировать внутреннюю силу путем добавления дополнительных вмешательств, важных аспектов физиологии скелетных мышц, включая, среди прочего, длину, силу, скорость и силу. Могут быть выявлены взаимосвязи кальция.