Использование мягких агар колонии Формирование анализе для идентификации ингибиторов туморогенности в клетках рака молочной железы

Здесь мы документируем использование анализа образования колоний мягкого агара для проверки влияния ингибитора фермента пептидиларгининдеиминазы (PADI), BB-Cl-амидина, на опухолевую генность рака молочной железы in vitro.

Общая цель этой процедуры заключается в количественном определении влияния лечения на способность клеток к пролиферации в полутвердых матрицах, поскольку повышенная способность является отличительной чертой генности опухоли клетки с использованием анализа мягкого агара. Генность опухоли измеряется через способность клетки образовывать колонии внутри полутвердого геля AROS. Поскольку нетрансформированные клетки не могут быстро размножаться в этой среде, полутвердый гель AROS создается путем создания нижнего слоя 0,6% AROS. Далее над нижним слоем добавляется ячейка, содержащая слой геля 0,3% AROS.

В этом анализе экспериментальные клетки обрабатываются ингибитором пептидила, аргинина, дазы или прокладочного фермента, разработанным доктором Субраманианом. Каждую неделю добавляется дополнительный слой питания, который представляет собой 0,3% гель aros с обработкой или без нее. Заключительным этапом является подсчет количества колоний размером более 70 микрометров для анализа.

В конечном счете, инвертированная микроскопия используется для того, чтобы показать разницу в количестве колоний между контрольной и лечебной группами. Привет, меня зовут Ачи Хута. Я учусь в аспирантуре лаборатории доктора Скотта Кроса в Институте здоровья животных Бейкера.

В Корнельском университете анализ образования мягких колоний тигров может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии рака, такие как оценка генности опухоли широкого спектра раковых клеток в отношении их чувствительности к лекарствам, гормонам и множеству других условий лечения. Начните эту процедуру с приготовления 3%2 гидроксиэтила в чистую сухую стеклянную бутылку объемом 100 миллилитров. Добавьте 0,9 грамма двух гидроксиэтил, а затем 30 миллилитров дистиллированной воды.

Разогрейте смесь в микроволновой печи в течение 15 секунд и аккуратно взболтайте. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока порошок AROS полностью не растворится. Далее автоклавируйте раствор, содержащий флакон в течение 15 минут.

Дайте агросному раствору остыть до комнатной температуры. Перед дальнейшим использованием подогрейте несколько пяти- и 10-миллилитровых пипеток в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы предотвратить затвердевание пипеток в пипетке. При частичном обращении ослабьте крышку бутылки и разогрейте в микроволновой печи готовый раствор 3%two HYDROXYETHYL aro в течение 15 секунд.

Затем аккуратно взболтайте раствор и поставьте в микроволновую печь еще на 15 секунд. Будьте осторожны при закручивании раствора ARO, потому что раствор поднимается вверх при воздействии воздуха и может разлиться, если в микроволновой печи бутылки есть остатки твердого геля. Еще несколько секунд подержите бутылку с раствором ARO на водяной бане при температуре 45 градусов Цельсия во время следующих шагов, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание агрораствора.

Далее перелейте 12 миллилитров подогретой среды с помощью пипеток Prewarm в стерильную коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Сразу же добавьте три миллилитра 3%-ного раствора ароса и аккуратно переверните коническую трубку, чтобы смешать арос со средой. Затем аккуратно добавьте по два миллилитра этой смеси в каждую лунку из шести лунок культуральной тарелки, не образуя пузырьков воздуха.

Инкубируйте шестилуночную культуральную пластину горизонтально на плоской поверхности при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного часа, чтобы смесь затвердела. После того как смесь застынет, поместите пластину в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 30 минут. Теперь нижний слой готов к использованию.

Сложным аспектом этой процедуры является обеспечение равномерного распределения всех ячеек и того, что расплавленная оболочка агры не затвердевает перед добавлением в каждую лунку, чтобы обеспечить смешивание сельца в среде перед добавлением жидкого агригеля. Кроме того, трубы предварительно прогреваются, чтобы избежать затвердевания растворов во время работы. Для приготовления клетки, содержащей слой трипсина, сначала глазами MCF 10 DCIS разбавляют клетки и разбавляют их до клеточной концентрации 40 000 клеток на миллилитр, затем берут восемь миллилитров среды с помощью предварительно подогретых пипеток и перекладывают в стерильную 50 миллилитровую коническую пробирку.

Сразу же добавьте два миллилитра 3%aros в коническую трубку и аккуратно переверните, чтобы перемешать арос со средой. Избегайте образования пузырей. Затем возьмите два миллилитра клеток и обработайте их двумя микромолярными ВВ-хлораминами в ДМСО или только ДМСО в качестве контроля после обработки, смешайте клетки с 0,6% ВВ в разведении один к одному, чтобы получить концентрацию одного микромолярного ВВ-хлорамина.

Затем возьмите один миллилитр клеточной смеси и аккуратно добавьте на нижний слой шестилуночной культуральной пластины. Поместите шестилуночную культуральную пластину горизонтально на плоскую поверхность при температуре четыре градуса Цельсия не менее чем на 15 минут, чтобы дать верхнему слою застыть. После того как смесь застынет, поместите пластину в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на неделю перед добавлением слоя кормления.

Начните подготовку кормушки-несушки, разогрев в микроволновой печи предварительно приготовленный раствор 3%two гидроксиэтила, как и раньше, и уравновесив бутылку с агрораствором на водяной бане при температуре 45 градусов Цельсия, смешайте один миллилитр 3%-ного раствора агро с девятью миллилитрами теплой среды в конической трубке объемом 50 миллилитров и аккуратно переверните, чтобы смешать арос с средой. Избегайте образования пузырьков воздуха. После обработки смеси ВВ хлорамином аккуратно добавьте по одному миллилитру смеси в каждую лунку из шести лунок питательной пластины, содержащей нижний и мягкий слои.

Затем поместите шестилуночную культуральную пластину горизонтально на плоскую поверхность при температуре четыре градуса Цельсия не менее чем на 15 минут, чтобы смесь застыла. После того как слой питателя застынет, поместите пластину в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. Бейдер повторяйте эту процедуру кормления еженедельно, нанося один миллилитр 0,3% раствора для обработки агрос на существующий слой питателя, чтобы пополнить клетки новыми средами до тех пор, пока не будет наблюдаться образование колоний.

После двух с половиной недель роста клеток в мягком агаре подсчитывается количество колоний в каждой лунке. Используя световой микроскоп для облегчения количественной оценки, напечатайте сетку на прозрачном материале и прикрепите сетку к шестилуночной пластине, чтобы помочь определить, где находятся клетки во время подсчета. Размер колонии количественно измеряется диаметром каждой колонии и будет варьироваться в зависимости от размера базовой колонии, чтобы определить, какие колонии будут засчитаны.

Например, здесь в анализ данных включаются размеры колонии 70 микрометров и более. После подсчета запечатайте шестилуночный планшет с параформом, чтобы предотвратить высыхание гелей. Храните образцы при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы предотвратить дальнейшее образование колоний и для будущего подсчета.

Результаты показывают, что BB-хлорамин значительно ингибирует образование колоний, полученных из клеток MC 10 DCIS, в присутствии ингибитора прокладок. Наблюдалось уменьшение как образования колоний, так и размеров колоний по сравнению с контролем ДМСО. Размер колоний для обработанных ВВ хлорамином клеток MCF 10 DCIS преимущественно находился в диапазоне от 20 до 100 микрометров.

В то время как размер колоний для контроля ДМСО демонстрировал больший диапазон от 70 до 150 микрометров после двух с половиной недель роста, были подсчитаны и проанализированы колонии размером более 70 микрометров. В среднем в контрольной группе ДМСО находилось около 3500 колоний, в то время как в группе, получавшей хлорамин, было замечено только около 2000 колоний. После двух с половиной недель щадящего земледелия это представляет собой 44%-ное снижение среднего образования колонии в присутствии одного микромолярного BB-хлорамина, что указывает на значительное онкогенное ингибирование клеток рака молочной железы ингибитором PAD.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о предварительном подогреве всех реагентов и оборудования, чтобы избежать затвердевания растворов при работе, и спасибо за наблюдение.