Количественный анализ восхождение дефектов в Drosophila модели нейродегенеративных расстройств

Общая цель данной процедуры заключается в количественной оценке способности к перемещению вверх (климбинга) мух дикого типа и мух с мутациями в генах, отвечающих за локомоцию. Для этого сначала мух переносят в мерный стеклянный цилиндр. На втором этапе мух перемещают на дно цилиндра, осторожно постукивая по нему, установленным на вспененной подложке.

Затем пересечение целевой линии следующими мухами регистрируется с помощью видеокамеры в течение двух минут. Заключительным этапом является анализ видеозаписей и построение графика количества мух выше целевой линии с интервалом в 10 секунд. В конечном итоге тест на способность к лазанию используется для выявления дефектов этой способности у мутантных линий плодовых мушек.

Основным преимуществом данного метода, как и существующих методик, таких как метод тестирования в естественных условиях («wild method»), является возможность выявления незначительных различий в способности к лазанию. Этот метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области нейродегенеративных расстройств, например, о роли специфических генов при наследственной спастической параплегии в прогрессирующем нарушении походки. Применение данной методики направлено на разработку терапии.

Метод анализа способности к лазанию (IP) применяется при изучении неврологических расстройств, так как он представляет собой простой количественный анализ для тестирования ответа на препараты и мутаций в генах-кандидатах на нейродегенерацию. Начните с анестезии 20 мух с помощью углекислого газа, после чего поместите всех мух в коллекционный флакон размером 25 мм на 95 мм, содержащий корм. Затем храните флакон с мухами горизонтально в картонном лотке, чтобы они не оказались в жидкости, которая может скопиться на дне флакона. Поместите мух в инкубатор минимум на 21 час при 12-часовом цикле «свет-темнота». На следующее утро подготовьте тест на лазание, перенеся мух из флакона в стеклянный мерный цилиндр объемом 250 мл, и запечатайте верхнюю часть восковой пленкой, чтобы предотвратить побег мух.

Проводите эксперимент при комнатном освещении, температуре 22 °C и влажности 40%. Всегда проводите эксперименты в одно и то же время суток, чтобы избежать влияния циклов сна. Также отметьте положение цилиндра на столешнице, чтобы оно оставалось неизменным каждый день.

Подсчитайте количество погибших мух на дне цилиндра и в флаконах с кормом, запишите это число как показатель смертности. Затем установите видеокамеру на штативе. Осторожно сфокусируйте камеру на отметке 190 мл мерного цилиндра объемом 250 мл.

Постучите цилиндром от 5 до 10 раз по плотной пене из закрытых ячеек с силой, достаточной для того, чтобы мухи переместились на внутреннюю нижнюю поверхность. Затем другой рукой нажмите кнопку записи на камере. После этого, пока идет запись, постучите цилиндром шесть раз в четком неритмичном темпе.

Проводите каждое испытание в течение двух минут с момента последнего постукивания по пробиркам с мухами. В конце утилизируйте мух в 95% этаноле. После завершения одного испытания повторите этот тест на способность к подъему 10 раз, используя каждый раз 20 новых мух, чтобы выявить небольшие различия в локомоции между группами.

Помойте цилиндры в посудомоечной машине и просушите их в течение ночи, чтобы использовать повторно после завершения эксперимента. Для анализа показателей мух начните с просмотра видеозаписей каждого испытания. Записывайте общее количество мух, пересекающих целевую линию каждые 10 секунд. Если муха спускается обратно или падает, засчитайте эту муху как минус одну, а следующую муху, пересекающую целевую линию, запишите под тем же номером, что и муху, которая спустилась или упала.

Например, если 15-я муха падает ниже целевой линии, следующая муха, пересекшая линию, считается 15-й, а не 16-й. Затем вычтите количество погибших особей из общего числа мух, чтобы определить количество мух, оставшихся на испытательном участке. При работе с тяжелыми мутациями процент мух выше целевой линии в каждой временной точке позволяет выявить различные степени нарушения способности к подъему с помощью различных тестов на подъем.

Здесь было зафиксировано количество восьмидневных мух, поднявшихся к верхней части пустого флакона с кормом через 18 секунд, что не выявило значимых различий в Climbing behavior между двумя группами. С другой стороны, при использовании метода анализа способности к лазанию из данного протокола мухи-мутанты Bastin 17-7/TM3 демонстрируют снижение показателей по сравнению с контрольной группой. Поскольку многие двигательные расстройства носят прогрессирующий характер, важно наблюдать за состоянием мух в динамике.

В возрасте двух дней наблюдается значительная разница в количестве мух, поднявшихся выше контрольной линии, по сравнению с контрольной группой. Способность к лазанию продолжает снижаться по мере старения мух-мутантов с двух дней.

При наличии соответствующего опыта этот эксперимент и последующий анализ можно выполнить за три часа. После просмотра данного видео вы должны будете четко понимать, как количественно оценивать нарушения локомоции в моделях мутантов zebrafish для изучения неврологических расстройств.