Анализ функций тучных клеток In Vivo с использованием 'Mast Cell Knock-in'Mice

Общая цель данного метода заключается в анализе функций тучных клеток in vivo с использованием мышей с выбиванием тучных клеток. Это достигается путем предварительного получения культивируемых тучных клеток, полученных из костного мозга, или BMC MCs, или приживления мышам с дефицитом тучных клеток. На втором этапе МК BMC адоптивно переносятся в различные анатомические участки мышей с дефицитом тучных клеток для получения мышей с выбиванием тучных клеток.

В конечном счете, количество и анатомическое распределение адоптивно перенесенных тучных клеток оцениваются с помощью проточной цитометрии и иммуногистохимического анализа, чтобы оценить, в какой степени приживленные популяции напоминают те, которые обнаружены у мышей дикого типа. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она позволяет напрямую оценить функции привитого типа стенки или генетически модифицированных популяций клеток МА in vivo. Таким образом, этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии МА, например, в какой степени клетки МА или их продукты могут влиять на особенности мышиных моделей физиологических, иммунологических или патологических процессов, включая модели заболеваний человека.

Как правило, люди, изучающие этот метод, могут испытывать трудности, потому что приживление и дефицит тучных клеток могут варьироваться в зависимости от метода, используемого для получения КМК КМК, корня инъекции, количества введенных МК БМК и количества недель после приживления перед проведением экспериментов in vivo. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку аспекты процедуры приживления трудно изучить, если не видеть, как именно они выполняются. Чтобы извлечь костный мозг в первую очередь, используйте стерильные инструменты для вскрытия бедренной кости, большеберцовой и малоберцовой костей у мышей дикого типа, не повреждая костный эпифиз.

Когда каждая кость будет рассечена, закрепите ее щипцами и соскребите всю постороннюю ткань. Затем поместите кость в PBS на лед, когда все кости будут собраны, перенесите ее в капюшон для стерильных тканей, затем по одной, закрепите каждую кость щипцами и отрежьте оба эпифиза, чтобы обнажить медуллярные полости. Затем, используя три миллилитровых шприца, оснащенных иглами 30 калибра и промывающей холодной средой, весь красный мозг из каждой кости помещают в новую чашку Петри. Когда все кости будут промыты, используйте тот же шприц для диссоциации кластеров клеток костного мозга путем повторной мягкой аспирации и выброса.

Затем переложите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Наполните пробирку холодной промывочной средой и центрифугируйте ячейки для восстановления. Суспензируйте клеточную гранулу в 10 миллилитрах питательной среды.

Затем переложите клетки костного мозга в колбу для культуры тканей соответствующего размера. После одного-двух дней культивирования перенесите клетки, не прилипшие к крови, в новую колбу вместе с 10 миллилитрами свежей культуры, средней дозой на каждую мышь в течение следующих недель. Кормление клеток раз в три-четыре дня как раз и демонстрируется.

Перенос клеток, не прилипших к адгезии, в новую колбу один раз в неделю до тех пор, пока не останутся клетки адгезии для внутрикожного приживления в ушной штифт Resus. Суспендируйте МЦ BMC в соотношении от четырех до 10 до семи клеток на миллилитр в холодном DMEM. Затем аспирируйте клетки в одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой 30 калибра, и поместите шприц на лед.

Затем подтвердите достаточную глубину анестезии верхним щипком четырех-шестинедельной мыши-реципиента с дефицитом тучных клеток и нанесите глазную мазь для введения клеток. Указательным пальцем обнажите и растяните вентральную поверхность ушного штифта, создавая вертикальное давление на тыльную сторону уха. Затем введите 1 25 микролитров внутрикожной инъекции один раз по 10 раз в шесть BMC MC в середину уха и вторую инъекцию 25 микролитров того же объема в направлении кончика штифта.

При внутрибрюшинном вживлении приживление ресуспендируют МК BMC в соотношении от 10 до 7 клеток на миллилитр при холодном DMEM. Затем с помощью одномиллилитрового шприца, оснащенного иглой 25 калибра, введите два раза по 10 из шести КМЦ БМ в 200 микролитрах среды в брюшную полость реципиентов с дефицитом тучных клеток для внутривенного приживления. Ресуспендируйте КМЦ BM в соотношении 2,5 раза по 10 до семи клеток на миллилитр в холодном DMEM, а затем вводите пять раз по 10 к шести MCC BMC в 200 микролитрах среды через хвостовую вену.

Через четыре-шесть недель после внутрибрюшинного приживления используйте пятимиллилитровый шприц, оснащенный иглой 25 калибра, чтобы ввести пять миллилитров холодного PBS в брюшную полость животного-реципиента. Массируйте живот в течение 20 секунд, чтобы собрать клетки брюшины. Затем с помощью пятимиллилитрового шприца, оснащенного иглой 22 калибра, медленно отсасывайте перитонеальный лаваж.

Процентное содержание тучных клеток и общее количество клеток в жидкости брюшинного лаважа могут быть затем оценены с помощью проточной цитометрии или гистохимического анализа. Чтобы оценить тучные клетки в брыжеечных окнах, разрежьте перитонеальную оболочку, чтобы обнажить кишечный тракт. Установите четыре-пять брыжеечных окон на каждую мышь на предметное стекло с последующей часовой фиксацией в шумовом растворе автомобиля.

Добавьте комнатную температуру в конце инкубации, высушите предметные стекла на воздухе и удалите кишечник. Неподвижные брыжеечные окна останутся прикрепленными к горкам. Наконец, окрашивание препаратов в течение 20 минут при комнатной температуре раствором для окрашивания Чаба представляет собой проточный цитометрический анализ и окрашивание КМЦ БМ синим цветом после одного 15 и 45 дней культивирования. В ДМЭМ, дополненных ИЛ, три КМЦ БМ культивируются в течение 45 дней и 95% чистоты и содержат большое количество цитоплазматических гранул.

Таким образом, клетки из этих культур пригодны для экспериментов по приживлению, в то время как клетки, культивируемые в течение 15 дней, на этих изображениях отсутствуют. Успешное приживление ушной пенни через четыре недели после внутрибрюшинного приживления показано как ожидалось, приживление брыжеечных окон, брюшной полости через шесть недель после внутрибрюшинного приживления и легкого через 12 недель после внутривенного приживления. Тучные клетки присутствуют в образцах тканей, выделенных от мышей дикого типа, в то время как тучные клетки не обнаруживаются у животных с дефицитом тучных клеток у мышей с тучными клетками.

Тем не менее, усыновленные МК BMC появляются в местах, аналогичных тем, которые наблюдаются у животных дикого типа. При попытке выполнить эту процедуру важно иметь в виду, что интервал между приживлением и изучением эксперимента будет варьироваться в зависимости от места введения тучных клеток. Очень важно соблюдать такие интервалы, чтобы дать приживленным клеткам достаточно времени для созревания и занятия конечного места vivo.

Этот подход предоставлял и продолжает предоставлять важную информацию о том, что массовая клетка и ее продукт могут или не могут делать in vivo. Пожалуйста, всегда помните, что работа с живыми животными требует специальной подготовки, соответствующего рассмотрения и утверждения протоколов экспериментов и строгого соблюдения самых высоких стандартов ухода за животными, включая заботу о снижении боли и стресса животного при выполнении этих процедур.