Анализ функций тучных клеток In Vivo с использованием 'Mast Cell Knock-in'Mice

Общая цель следующего метода заключается в анализе функций тучных клеток in vivo с использованием мышей с нокаутом по тучным клеткам. Это достигается путем первоначального получения культур тучных клеток из костного мозга (BMCs MCs) или их трансплантации мышам с дефицитом тучных клеток. На втором этапе BMC MCs подвергаются адаптивному переносу в различные анатомические области мышей с дефицитом тучных клеток для создания мышей с нокаутом по тучным клеткам.

В конечном итоге количество и анатомическое распределение адаптивно перенесенных тучных клеток оценивают с помощью проточной цитометрии и иммуногистохимического анализа, чтобы определить, в какой степени прижившиеся популяции соответствуют популяциям, обнаруживаемым у мышей дикого типа. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет напрямую оценивать функции прижившихся популяций тучных клеток дикого типа или генетически модифицированных клеток in vivo. Таким образом, данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии тучных клеток, например, в какой степени тучные клетки или их продукты могут влиять на характеристики мышиных моделей физиологических, иммунологических или патологических процессов, включая модели заболеваний человека.

Как правило, лица, осваивающие данный метод, могут столкнуться с трудностями, поскольку приживление и дефицит мастоцитов могут варьироваться в зависимости от метода получения КМК из костного мозга, места инъекции, количества вводимых мастоцитов из КМ и количества недель ожидания после приживления перед проведением экспериментов in vivo. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как некоторые аспекты процедуры приживления трудно освоить, не видя точно, как они выполняются. Для извлечения костного мозга сначала с помощью стерильных инструментов для диссекции выделите бедренную, большеберцовую и малоберцовую кости мышей дикого типа, не повреждая эпифизы костей.

При препарировании каждой кости зафиксируйте ее пинцетом и счистите все лишние ткани. Затем поместите кость в PBS на льду. Когда все кости будут собраны, перенесите их в стерильный ламинарный шкаф, после чего поочередно фиксируйте каждую кость пинцетом и отсекайте оба эпифиза, чтобы открыть костномозговые полости. Затем, используя трехмиллилитровые шприцы с иглами 30G и промывая холодной средой, вымойте весь красный костный мозг из каждой кости в новую чашку Петри. Когда все кости будут промыты, используйте тот же шприц для диссоциации скоплений клеток костного мозга путем повторного осторожного всасывания и выталкивания.

Затем перенесите суспензию клеток в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Заполните пробирку холодным промывочным раствором и центрифугируйте клетки. Ресуспендируйте клеточный осадок в 10 миллилитрах культуральной среды.

Затем перенесите клетки костного мозга в культуральный флакон соответствующего размера. После одного-двух дней культивирования перенесите неадгезивные клетки в новый флакон, добавив 10 миллилитров свежей культуральной среды на одну мышь, и повторяйте эту процедуру в течение последующих недель. Подкармливайте клетки каждые три-четыре дня, как показано в данной демонстрации.

Переносите неадгезивные клетки в новую колбу раз в неделю до тех пор, пока не останется адгезивных клеток для внутрикожного пересаживания в ушную раковину крыс. Суспендируйте BMC MCs в холодном DMEM в концентрации 4 × 10⁷ клеток/мл. Затем наберите клетки в шприц объемом 1 мл, оснащенный иглой 30G, и поместите шприц на лед.

Затем подтвердите достаточную глубину анестезии, проверив реакцию на щипок у мыши-реципиента с дефицитом тучных клеток в возрасте от четырех до шести недель, и нанесите глазную мазь перед введением клеток. С помощью указательного пальца обнажите и растяните вентральную поверхность ушной раковины, создавая вертикальное давление на дорсальную поверхность уха. Затем выполните первую внутрикожную инъекцию 25 µL суспензии BMC MCs в концентрации 1 × 10⁶ в среднюю часть уха, и вторую инъекцию 25 µL того же объема в область кончика раковины.

Для внутрибрюшинного приживления ресуспендируйте BM CMCs в холодном DMEM с концентрацией 1 × 10⁷ клеток/мл. Затем с помощью шприца объемом 1 мл, оснащенного иглой 25G, введите 2 × 10⁶ BM CMCs в 200 µL среды в брюшную полость реципиентов с дефицитом тучных клеток. Для внутривенного приживления ресуспендируйте BM CMCs в холодном DMEM с концентрацией 2,5 × 10⁷ клеток/мл, после чего введите 5 × 10⁶ BM CMCs в 200 µL среды через хвостовую вену.

Через четыре-шесть недель после внутрибрюшинной трансплантации с помощью шприца объемом 5 мл, оснащенного иглой 25 G, введите 5 мл холодного PBS в брюшную полость животного-реципиента. В течение 20 секунд массируйте живот для сбора перитонеальных клеток. Затем с помощью шприца объемом 5 мл, оснащенного иглой 22 G, медленно аспирируйте промывные воды брюшины.

Процентное содержание мастоцитов и общее количество клеток в перитонеальном лаваже затем можно оценить с помощью проточной цитометрии или гистохимии. Для оценки мастоцитов в брыжеечных окнах разрезните брюшину, чтобы обнажить кишечник. Поместите четыре-пять брыжеечных окон от каждой мыши на предметное стекло, после чего проведите фиксацию в растворе Карнуа в течение одного часа.

По окончании инкубации доведите температуру до комнатной, высушите стекла на воздухе и удалите кишечник. Фиксированные брыжеечные окна останутся прикрепленными к стеклам. Наконец, окрасьте препараты в течение 20 минут при комнатной температуре с помощью раствора для окрашивания чабой; представлены данные проточного цитометрического анализа и окрашивания в одиновый синий BM CMCs после 1, 15 и 45 дней культивирования в среде DMEM с добавлением IL-3. BM CMCs, культивируемые в течение 45 дней, характеризуются чистотой 95% и содержат большое количество цитоплазматических гранул.

Таким образом, клетки из этих культур пригодны для экспериментов по трансплантации, в то время как клетки, культивируемые в течение 15 дней, на данных изображениях таковыми не являются. Как и ожидалось, показана успешная приживаемость трансплантата в ушной раковине через четыре недели после внутридермальной трансплантации, в мезентериальных окнах и брюшной полости через шесть недель после внутрибрюшинной трансплантации, а также в легких через 12 недель после внутривенной трансплантации. В образцах тканей, выделенных из мышей дикого типа, присутствуют тучные клетки, тогда как у животных с дефицитом тучных клеток и у мышей с нокаутом тучных клеток они не обнаруживаются.

Тем не менее, адаптивно перенесенные MC из костного мозга появляются в тех же локациях, что и наблюдаемые у животных дикого типа. При выполнении этой процедуры важно помнить, что интервал между приживлением и началом исследования будет варьироваться в зависимости от места инъекции мастоцитов. Крайне важно соблюдать такие интервалы, чтобы обеспечить достаточное время для созревания пересаженных клеток и их перемещения в окончательное положение vivo.

Данный подход предоставил и продолжает предоставлять важную информацию о том, что могут или чего не могут делать масс-клетки и их продукты in vivo. Пожалуйста, всегда помните, что работа с живыми животными требует специального обучения, соответствующего рассмотрения и утверждения протоколов экспериментов, а также строгого соблюдения высочайших стандартов ухода за животными, включая принятие мер по снижению боли и стресса у животных при выполнении этих процедур.