Гибридная μCT-FMT изображений и анализа изображений

Флуоресцентная томография — это высокочувствительный метод визуализации для количественной оценки распределения флуоресценции. Для использования на обезболиваемых мышах доступно множество таргетных флуоресцентных зондов, которые позволяют визуализировать ангиогенез, апоптоз, воспаление и другие процессы. В данном видео мы продемонстрируем, как в нашем институте проводится гибридная визуализация с использованием FMT и Micro City.

В первой главе описываются устройства; в данном случае это FMT, что расшифровывается как флуоресцентная молекулярная томография. Томография означает, что создаются трехмерные изображения. FMT обладает высокой чувствительностью при визуализации эндогенной флуоресценции у мышей.

Теперь передняя панель открыта, и видна внутренняя часть FMT. В нижней части расположен лазер, установленный на 2D-сервоприводе. Лазер излучает свет в сторону мыши, которая зафиксирована в частично прозрачном ложе для мышей.

Над ложементом для мыши расположен массив Светодиодов в качестве альтернативного источника света, что позволяет ФМТ работать как обычное устройство для получения изображений в режиме отражения. Колесо фильтров установлено под линзой, которая собирает свет для детектора, расположенного в верхней части устройства. Это наша микро-КТ.

Микрокомпьютерный томограф (micro CT) оснащен двумя рентгеновскими трубками и двумя плоскопанельными детекторами, что позволяет выполнять сканирование с двумя уровнями энергии. Глава вторая, протокол сканирования FMT с использованием micro CT. Системы FMT и micro CT предназначены для визуализации мышей; перед началом процедуры мыши подвергаются анестезии изофлураном.

Для проведения ФМТ-сканирования необходимо удалить шерсть мыши, для чего хорошо подходит крем Depilatory (Herring cream). У некоторых линий мышей при использовании этого крема может возникнуть сыпь. Поэтому рекомендуется следить за состоянием кожи мышей и в случае необходимости обращаться за помощью к ветеринарному персоналу.

Кроме того, для начала проверьте переносимость на небольшой группе любых новых линий мышей. Для предотвращения гипотермии мышь помещают на грелку. Для введения контрастного вещества в хвостовую вену устанавливают катетер в связи с ее малым размером.

Это довольно сложная процедура, требующая определенного опыта. Если кровь поступает обратно в катетер, значит, он установлен правильно. Для предотвращения перегрузки объемом могут быть введены флуоресцентные контрастные вещества и контрастные средства для КТ.

Максимальный объем инъекции должен составлять 5 мл на килограмм массы тела, что соответствует 150 µL для мыши весом 30 г. Для сканирования мышь помещают в мультимодальную подстилку для мышей.

Для идентификации на хвосте мыши могут быть нанесены специальные метки. Важно избегать нанесения каких-либо знаков на туловище, так как это может повлиять на оптическое сканирование. Ложе для мыши закрывают, а глубину регулируют так, чтобы плотно зафиксировать мышь в неподвижном положении.

Будьте осторожны и следите за дыханием животного, так как слишком сильная затяжка фиксатора может привести к удушью мыши. В онкологических исследованиях часто используют голых мышей из-за их иммунодефицита. Отсутствие шерсти является благоприятным побочным эффектом генетической мутации.

Таким образом, трудоемкую процедуру удаления шерсти можно пропустить. Необходимо убедиться, что мышь дышит нормально, и при необходимости соответствующим образом отрегулировать ложе для мыши. Затем ложе с мышью помещают в микро-КТ.

Трубки, по которым транспортируется газ ISO fluorine, переключаются для поддержания потока газа внутри устройства. Затем micro C закрывается для активации рентгеновского экранирования. Сканирование в micro C начнется только после закрытия крышки.

С помощью кнопок на микро-КТ мышь можно переместить внутрь сканера. На управляющем компьютере микро-КТ выполняется и отображается топограмма; настройки окна регулируются для лучшей визуализации мыши. Можно установить один или несколько ZUP-сканов. Их положение обозначено светло-голубыми областями.

Обычно достаточно одного-трех сканирований ZUP. После запуска сканирования прогресс отображается темно-синими индикаторами выполнения. Наш плоскопанельный микро-КТ сканирует ZUP последовательно, что отличается от клинической спиральной КТ.

С помощью кнопок ложе для мыши перемещают вперед. Снова открывают защитную крышку и переключают трубки для подачи анестетика. Держатель осторожно извлекают из ложа для мыши, а трубку с анестетиком вытягивают наружу.

Это необходимо, так как анестезия и FMT не зависят от этой маленькой трубки. Вместо этого внутренняя малая камера FMT заполняется газ-анестетиком. Теперь ложе с мышью перемещают к FMT и устанавливают под управлением компьютера FMT.

Настраиваются поле сканирования и плотность дискретизации. Обычно используется около 120 точек. Сканирование начинается после нажатия кнопки.

На первом этапе ФМТ регистрируется изображение при транс-иллюминации или возбуждении для каждой точки источника лазерного излучения. В данном видео этот процесс показан в ускоренном режиме. Обычно он занимает около пяти минут.

Заметно, что через верхнюю часть тела проходит значительно меньше света, чем через нижнюю. Это объясняется тем, что органы с более высоким относительным объемом крови, такие как сердце, печень и почки, расположены преимущественно в верхней части тела. Кровь является основным поглотителем ближнего инфракрасного излучения.

При повторном проходе тех же исходных точек используется другой фильтр, который пропускает только флуоресцентный свет. Глава три, интерактивное совмещение и сегментация. Для объединения данных с обоих устройств используются маркеры, встроенные в ложе для мыши.

Маркеры также видны на рефлекционном изображении, полученном с помощью FMT. На самом деле маркеры представляют собой простые отверстия, которые не требуют заполнения какими-либо флуоресцентными или КТ-контрастными веществами. В нашем институте мы разработали программное обеспечение, которое выполняет детектирование и совмещение маркеров в автоматическом режиме.

Форма мыши, а также неоднородные карты поглощения и рассеяния автоматически оцениваются с использованием данных микро-КТ, как описано в нашей недавней публикации в журнале Theranostics. Эти параметры важны для количественной реконструкции флуоресценции. Для измерения биораспределения флуоресценции необходима сегментация органов.

Далее мы интерактивно создаем такую сегментацию с помощью программного обеспечения imulitic preclinical, разработанного в нашем институте. Процесс создания сегментации показан в ускоренном режиме; опытный специалист может выполнить его примерно за 10–20 минут. Сначала загружается набор данных КТ.

Его можно осмотреть в 3D с помощью рендеринга изоповерхности. Изменяя настройки окна, можно менять значение ISO. Например, для визуализации костей всего тела мыши вместе с ложем для мыши загружается наложение.

Сигнал в данном примере наблюдается в мочевом пузыре. Теперь наложение визуализации отключено, чтобы сосредоточиться на анатомической сегментации.

На нативных снимках микро-КТ легкие легко обнаружить благодаря сильному отрицательному контрасту по сравнению с другими мягкими тканями. Крупная структура внутри легких — это сердце. Сначала выполним сегментацию легких.

Все воксели ниже определенного значения сегментируются с помощью пороговой фильтрации. Эти области отображаются зеленым цветом. Легкое представляет собой связную область, которую можно выделить с помощью операции заполнения.

Аналогично инструменту «заливка». В программе для рисования сосуд можно отделить от легкого с помощью функций обрезки и заполнения. Выпуклые органы, такие как мочевой пузырь, можно сегментировать, рисуя произвольные линии для обозначения границ органа.

Добавление штрихов продолжается до достижения достаточной точности. Невыпуклые органы, такие как кишечник, могут быть сегментированы по частям. Печень выглядит как гомогенная область и обладает более сложной структурой.

Поскольку орган состоит из нескольких долей, сегментацию можно сохранить на диск и затем загрузить в программу. Используя такую сегментацию, можно соотнести флуоресцентный сигнал с соответствующими органами. Программа вычисляет эти значения и сохраняет их в виде дополнительного листа; для лонгитюдных исследований сегментацию необходимо проводить повторно для каждой временной точки, так как интервалы обычно слишком велики, чтобы поддерживать мышь под наркозом в фиксированном положении.

Таким образом, сегментация становится трудоемкой задачей, если в исследовании участвует большое количество мышей и используются многие временные точки. Для количественной оценки результатов загрузите наложение и сегментацию. Нажмите «set Batch settings», чтобы программа запомнила текущие настройки.

Теперь нажмите «batch statistics», чтобы программа рассчитала значения для всех областей на всех снимках микро-КТ FMT. Это займет несколько секунд. Затем статистика будет сохранена в одном файле электронной таблицы.

Это удобно, так как пользователю не приходится самостоятельно объединять десятки файлов. На основе этого файла можно рассчитать кривые органов. Глава четвертая, репрезентативные результаты.

Для проверки правильности работы слияния мы использовали фантом aros. Для создания эффекта рассеяния был добавлен порошок экзида титана. Чтобы получить неправильную форму, некоторые части были срезаны.

В фантом были встроены несколько небольших включений, заполненных флуоресцентным и КТ-контрастным веществами. Поскольку FMT не знает истинной формы объекта и предполагает упрощенную геометрию, реконструкция для объектов с неправильной формой оказывается неточной. В связи с этим мы реализовали другой метод реконструкции, в котором используется форма, полученная на основе данных микро-КТ.

Как видите, локализация сигнала в фантоме стала значительно лучше. Чтобы изучить данные in vivo, давайте рассмотрим временные точки визуализации. Это предварительное сканирование.

То, что мы видим, по сути, представляет собой просто шум и артефакты. Если перейти к следующей временной точке, после инъекции, мы заметим гораздо более сильный сигнал, однако настройки окна слишком жесткие. С помощью диалогового окна регулировки окна вы можете изменить эти параметры.

Большая часть сигнала наблюдается в мочевом пузыре. Если перейти к следующему временному интервалу, через 0,2 часа после инъекции, мы видим некоторый сигнал за пределами тела мыши. Это произошло из-за того, что мышь вывела флуоресцентный сигнал с мочой на подстилку.

При дальнейшей корректировке окна визуализации мы можем заметить сигнал в области позвоночника и коленей. Теперь перейдем к моменту времени 0,4 часа после инъекции: сигнал от мочи теперь исчез, и мы наблюдаем флуоресценцию в области позвоночника и коленей для следующих временных точек — через шесть часов и 24 часа после инъекции. Мы видим ту же картину.

Теперь перейдем к следующему носу. На предварительном сканировании при данных настройках окна ничего не обнаруживается. Сканирование через 15 минут после инъекции показывает сильный сигнал от мочевого пузыря и так далее.

В данном исследовании мы обнаружили высокие концентрации в мочевом пузыре вскоре после инъекции, что стало следствием быстрого почечного выведения данного зонда. Кроме того, сигнал в позвоночнике быстро возрастает и остается относительно стабильным на более поздних временных точках визуализации. Глава пять, заключение.

В заключение мы представляем протокол мультимодальной визуализации, объединяющий преимущества флуоресценции, молекулярной томографии и микрокомпьютерной томографии. Анатомические данные микро-КТ позволяют улучшить реконструкцию флуоресценции за счет использования контуров тела мыши. Кроме того, этот метод полезен для сегментации органов, которая необходима для получения количественных показателей из данных изображений.