Высокая пропускная способность измерения внеклеточной ДНК-релиз и количественный NET Формирование в нейтрофилах человека In Vitro

Общая цель этой процедуры заключается в количественном определении внеклеточных ловушек нейтрофилов, или НВЛ, высвобождаемых нейтрофилами человека в масштабах высокой пропускной способности. Представленные здесь методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области воспаления и изменяющих воспалительных заболеваний путем изучения механизма и регуляции образования внеклеточных ловушек нейтрофилов in vitro в нейтрофилах человека. Применение этого метода включает в себя идентификацию центральных опосредующих сигнальных путей НВЛ и ингибирующих или стимулирующих НВЛ молекул.

Чтобы выделить нейтрофилы из крови, необходимо ввести 20 миллилитров человеческой крови в конические пробирки объемом 250 миллилитров. Добавьте 10 миллилитров 6%-ного декстрана, затем аккуратно перемешайте и дайте растворам настояться при комнатной температуре в течение 20 минут. Осторожно перенесите богатую лейкоцитами верхнюю фазу в чистые 50-миллилитровые конические пробирки и используйте стерильный PBS для заполнения пробирки до верха.

Затем центрифугируйте образец при 400-кратном G в течение десяти минут и используйте 15 миллилитров стерильного PBS для ресуспендирования гранулы. Повторите этот шаг стирки еще раз. Затем приготовьте пятиступенчатые перколл градиенты 85, 80, 75, 70 и 65 процентов в конических пробирках объемом 215 миллилитров и нанесите два миллилитра лейкоцитарной суспензии поверх каждого градиента.

Затем центрифугируйте градиенты при 800 умноженных на G в течение 30 минут с отрывом. После центрифугирования соберите клетки в слои на границах раздела 75-80% и 70-75%. Используйте PBS для промывки клеток дважды, а затем используйте гемоцитометр для подсчета клеток.

Чтобы измерить кинетику высвобождения внеклеточной ДНК, готовят суспензию нейтрофилов в исследуемой среде в концентрации от двух до десяти до шести клеток на миллилитр. Добавьте пять микромолей на литр оранжевого SYTOX, который является непроницаемым для мембран красителем для связывания ДНК, и аккуратно перемешайте. Аликвотируйте человеческие нейтрофилы в стерильные 96-луночные черные прозрачные донные микропланшеты, гарантирующие, что исследуемая среда покрывает все дно лунки.

Если нет, аккуратно постучите по тарелке сбоку. Прогрейте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. В то же время используйте среду для анализа при температуре 37 градусов Цельсия для приготовления растворов, содержащих стимулы в двойных концентрациях от используемых конечных концентраций.

В качестве положительного контроля НВЛ приготовьте 100 наномолярного форболмиристатацетата (PMA) для лечения нейтрофилов человека в течение четырех часов, чтобы вызвать максимальное высвобождение НВЛ. Далее подготовьте микропланшетный флуориметр к измерению. Стимулируйте нейтрофилы, добавляя 50 микролитров раствора стимула к 50 микролитрам суспензий нейтрофилов.

Добавьте конечную концентрацию 0,5 миллиграмма на миллилитр сапонина в одну лунку, чтобы измерить максимальный сигнал высвобождения ДНК. Поместите планшет в считыватель и измеряйте изменения флуоресценции с интервалом в две минуты в течение четырех часов без встряхивания. Чтобы проанализировать данные, рассчитайте нормализованное увеличение флуоресценции с течением времени, вычитая базовую флуоресценцию из значений конечных точек для всех лунок, включая сапонин.

Повышение флуоресценции сапонинов должно быть самым высоким сигналом и называется максимальным высвобождением ДНК. Усреднить результаты репликаций и представить их в процентах от максимального высвобождения ДНК. Для количественного определения образования НВЛ с помощью анализов МПО-ДНК и HNE-ДНК ИФА добавьте антитела против МПО или захвата HNE в 96-луночные планшеты ИФА с высокой связывающей способностью и инкубируйте их в течение ночи для нанесения покрытия.

На следующее утро используйте 200 микролитров на лунку PBS, чтобы трижды промыть пластины ИФА. Затем используйте 200 микролитров 5% бычьего сывороточного альбумина, или BSA, и 0,1% человеческого сывороточного альбумина, или HSA, чтобы заблокировать лунки при комнатной температуре на два часа. В то же время затравливают нейтрофилы в 100 микролитрах пробирной среды на 96-луночном планшете с плотностью 100 000 клеток на лунку и индуцируют образование НВЛ после добавления стимулов путем инкубации при 37 градусах Цельсия в течение четырех часов.

Затем проведите ограниченное расщепление ДНКазы, добавив две единицы на миллилитр ДНКазы к надосадочной жидкости нейтрофилов, затем хорошо перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем остановите реакцию, добавив 15 микролитров 25 миллимолярных EGTA и хорошо перемешайте. Соберите надосадочную жидкость и очистите пробирки с микрофугой и вращайте образцы, чтобы избавиться от клеточного мусора при 300-кратном перегрузке и комнатной температуре в течение пяти минут.

Сбор НВЛ без ограниченного переваривания приводит к несогласованности данных. Ограниченный этап расщепления ДНК имеет решающее значение для получения воспроизводимых результатов. Таким образом, концентрация фермента ДНКазы I и продолжительность пищеварения были оптимизированы.

Перенесите надосадочную жидкость в чистые микропробирки и держите на льду. Затем, используя аликвоту заранее приготовленного стандарта НВЛ, готовят одно-два разведения в PBS и EGTA. Теперь используйте PBS с EGTA, чтобы разбавить образцы ДНКазы, которые я переварил, в двадцать раз и аликировать их на планшетах ИФА, покрытых антителами захвата.

Инкубируйте пластины в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Перед использованием PBS для трехкратной промывки планшетов нанесите 100 микролитров на лунку раствора антитела для обнаружения, такого как конъюгированное антитело против ДНК пероксидазы хрена, и инкубируйте в темноте в течение одного часа. После четырех промываний PBS добавьте 100 микролитров субстрата TMB peroxidasa и инкубируйте в течение 30 минут.

Синяя окраска указывает на активность пероксидазы и наличие НВЛ. Чтобы остановить реакцию, добавьте 100 микролитров одного моляра HCL. Синие растворы станут желтыми.

С помощью микропланшетного фотометра считайте поглощение на 450 нанометрах. Чтобы сравнить количество измеренных комплексов MPO-DNA или HNE-DNA по сравнению со стандартом NET, вычтите оптимальную фоновую плотность из всех образцов и соотнесите значения поглощения разбавленных стандартных образцов с их относительным содержанием NET. Используя ненасыщенный диапазон этой стандартной кривой, установите линию тренда, используя наилучшее экспоненциальное соответствие используемого программного обеспечения.

Вставьте измеренные значения OD неизвестных в уравнение линии тренда, которое даст количество НЭО в неизвестной выборке в процентах от стандарта НВЛ. Наконец, рассчитайте средние значения репликатов и представьте окончательные данные в виде количества комплексов MPO-DNA или HNE-DNA. Здесь представлены репрезентативные данные флуоресцентного анализа высвобождения ДНК нейтрофилов человека, оставленных без стимуляции или активированных PMA или P-aeruginosa.

P-aeruginosa вызывает образование НВЛ в PMN человека. Этот график иллюстрирует, что средние значения увеличения флуоресценции реплицирующих лунок рассчитываются, нормализуются по максимальной флуоресценции и выражаются в виде высвобождения ДНК. Эти флуоресцентные изображения представляют нейтрофилы, оставленные без лечения или стимулированные PMA.

Здесь представлены иммунофлуоресцентные изображения нестимулированных, активированных PMA и PA01 нейтрофилов человека из анализа MPO-DNA и HNE-DNA Elisa. Внеклеточная ДНК демонстрирует типичную морфологию НВЛ и колокализуется с МПО и цитруллинированным гистоном H4, маркером образования НВЛ. Этот эксперимент показывает высвобождение MPO-ДНК и HNE-ДНК в нейтрофилах человека с использованием одного и того же анализа.

Стандарт НЭО в среднем содержит 19,5 микрограммов на миллилитр внеклеточной ДНК, 399 нанограммов на миллилитр МПО и 103,4 нанограмма на миллилитр НЭ. Основываясь на молекулярной массе МПО и HNE, а также на том, что один микрограмм ДНК содержит от 9,91 до 10 до 14 нуклеотидов, стандарт НЭО содержит 109 молекул HNE и 147 молекул МПО на 1000 нуклеотидов. Наконец, два эксперимента по серийному разведению стандарта НВЛ показали, что динамические диапазоны анализов МПО-ДНК и HNE-ДНК ИФА составляют от 19 до 609 нанограммов на миллилитр ДНК.

После освоения кислоту на основе апельсина SYTOX можно легко и быстро собрать за один час, что приведет к получению результатов уже на следующий день. Количественный анализ NET также прост в выполнении и приведет к получению данных на следующий день при правильном выполнении. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как количественно определять натуразу в нейтрофилах человека с высокой пропускной способностью.