Метод измерения активности ферментов Deubiquitinating в клеточных линиях и образцы тканей

Общая цель данного эксперимента — визуализировать активность убиквитинированных ферментов в клетках. Это достигается путем культивирования клеток до высокой плавности и их сбора для облегчения производства концентрированного лизата в качестве второго этапа. Щадящий механический лизис используется для получения лизата, который поддерживает метаболическую картину цитоплазмы клетки.

Затем ферменты инкубируют с зондами, производными гемагглютинина, чтобы пометить ферменты деубиквитина путем реакции с остатком цистеина активного центра, результаты показывают профили активности многих ферментов деубиквитина на основе вестерн-блоттинга и последующего хемилюминесцентного детектирования. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как обычный вестерн-блоттинг, заключается в том, что она позволяет пользователю визуализировать активность нескольких ферментов. В одном из экспериментов, «Приготовление среды для клеточных культур» Али, цитируя 30 миллилитров dobe docos, модифицированную среду eagles или DMEM плюс 10% фетальной бычьей сыворотки в 50-миллилитровой конической пробирке для культивирования.

Клетки для эксперимента переносят замороженные клетки М 17 или А из хранилища жидкого азота в небольшой стакан с теплой водой. Затем переложите клетки в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую 30 миллилитров среды. Затем добавьте немного среды во флакон с клетками и перенесите ресуспендированные клетки в течение пяти секунд после оттаивания.

Центрифугируйте клеточную суспензию при 450 G в течение пяти минут для получения клеточной гранулы. Затем добавьте 20 миллилитров среды в колбу T 75. Удалите среду из клеток с помощью отсасывания.

Добавьте пять миллилитров свежей среды в клеточную гранулу и восстановите суспенд. Перенесите пять миллилитров клеточной суспензии в 20 миллилитров среды в колбу Т 75 и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия. Смена среды каждые три дня для сбора клеток.

Удалите медиа с помощью отсасывания, стараясь не касаться клеток. Промойте клетки пятью миллилитрами фосфатно-солевого буфера или PBS. Удалите PBS с помощью отсасывания.

Далее добавьте в колбу T 75 три миллилитра трипсин ЭДТА и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех минут. После инкубации добавьте в колбу шесть миллилитров свежей среды и ресус. Подвешиваем клетки.

Переложите суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при 290 Gs в течение пяти минут, удалите надосадочную жидкость и добавьте пять миллилитров PBS. Осторожно постучите по дну пробирки, чтобы разбить гранулу перед центрированием при давлении 290 G в течение пяти минут. Повторив промывку PBS три раза, удалите старую PBS и повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре свежей PBS.

Затем поместите элементы в эйноровую трубку и вращайте при давлении 290 GS в течение пяти минут. Чтобы выполнить лизис клеток, измерьте приблизительный объем гранулы с помощью пипетки и взвесьте стеклянные шарики и соотношение массы к объему один к одному. Добавьте в гранулу буфер для лизиса в два раза больше объема гранулы.

Затем добавьте стеклянные шарики в гранулу и лизис. Буферизируйте клетки в эйноровой трубке при максимальном перемешивании в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия путем вортекса в холодном помещении. Кратковременно центрифугируйте при 200 GS в течение 30 секунд.

Для оседания бусин и сбора надосадочной жидкости. Добавьте в надосадочный вихрь тот же объем стеклянных шариков, что и раньше, еще раз при максимальном перемешивании в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия после кратковременного центрирования при 200 G в течение 30 секунд. Чтобы осесть стеклянные шарики, соберите надосадочную жидкость.

Наконец, центрифугируйте при 5, 030 GS в течение пяти минут. Чтобы удалить ядра, мембраны и неповрежденные клетки, соберите надосадочную жидкость, которая является лизатом клеток для деривации тканей, выполняемой методом Cinco nimic acid, или анализа БЦА. В 96-луночном планшете для определения концентрации белка лизата с помощью считывателя 96-луночного планшета Холеметрии в соответствии с протоколом набора для анализа белка BCA.

После определения концентрации белка доведите аликвоту, соответствующую 20 микрограммам общего белка, до 50 микролитров с помощью деионизированной воды. Затем добавьте в раствор два микролитра 1,35 микромоля HAUB vinyl сотового телефона. В результате получается 20 микрограммов лизата на 50 наномоляров зонда в конечной реакционной смеси.

Это при большом избытке моляров. Чтобы обеспечить маркировку функциональных ферментов убиквитина или дубов, оставьте раствор инкубироваться в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. Далее добавьте в раствор буфер для образцов laly.

Для реакционного объема 52 микролитра используйте 26 микролитров двух буферов для образцов, 13 микролитров четырех буферов для образцов или 8,87 микролитров из шести буферов для образцов. Инкубируйте образец в течение пяти минут при температуре 95 градусов Цельсия. Остудите на льду.

Перед загрузкой геля выполнить вестерн-блоттинг сначала загрузите 12, ну от четырех до 20% трис глицина гелем с 40 микролитрами подготовленного образца. Запустите гель при напряжении 95 вольт, пока фронт ионов не достигнет дна. Затем проведите ночной перенос геля на мембрану из полилозы DI фторида или PVDF.

Сначала инкубируйте мембрану в черном пятне AMDO и просканируйте мембрану, чтобы получить изображение, показывающее количество белка в каждой полосе. Затем задержите мембрану и инкубируйте в 5%-ном молоке в PBS в течение одного часа для блокировки. Затем инкубируйте мембрану в первичном антителе против ГК в концентрации от одного до 10 000 в 5%-ном молоке PBS либо в течение ночи при четырех градусах Цельсия, либо в течение четырех часов при комнатной температуре.

После инкубации выполните три промывки в течение пяти минут каждая в PBS с 0,1%tween 20 моющим средством. Затем инкубируйте мембрану в пероксидазе хрена мыши в концентрации от одного до 10 000 в 5%-ном молоке в PBS в течение не менее двух часов. Выполните три промывки, как и раньше, а затем одну промывку в течение пяти минут в PBS.

Наконец, инкубируйте мембрану в хемилюминесцентном реагенте в течение 10 минут и обнаруживайте с помощью люминесцентного детектора. Используйте автоматическую настройку экспозиции на детекторе. Белковую нагрузку проверяли с помощью красителя AM mito black.

Этот этап контроля гарантирует, что различия в активности обусловлены реальными клеточными процессами, а не неравномерной белковой нагрузкой. Показанные здесь полосы указывают на то, что в первом эксперименте использовалось равное количество белка. Во втором эксперименте были загружены неравные количества белка из-за ожидаемых различий в профилях активности различающихся клеточных линий.

Это было сделано для того, чтобы обеспечить обнаружение профиля активности для ячейки М 17. Лизаты инкубируются с этилмейдом, который является ингибитором цистина и должен приводить к снижению сигнала на вестерн-блот. Мембраны инкубировали в первичных антителах против HA.

Пероксидазу редьки мыши, а затем обнаруженную с помощью хемилюминесцентной визуализации. Успешное мечение дубляжей с помощью зондов приводит к образованию профиля на каждой полосе мембраны. Интенсивность полос при разной молекулярной массе соответствует уровню активности фермента даб

Различия в уровнях активности различных дабов между клеточными линиями становятся очевидными при сравнении подобных белков, таких как U CHL one, в клетках he a и M 17. После этой процедуры. Другие методы, такие как субклеточное фракционирование, могут быть выполнены, чтобы ответить на такие вопросы, как: как патологические процессы влияют на активность фермента убиквитина в мембраносвязанных органеллах?

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерить активность убиквитинированного фермента с помощью зондов, направленных на активный сайт.