Трансфекции клеток RAW264.7 с люциферазы гена

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы трансфектировать люциферазу в необработанные 2, 6, 4, 0,7 клетки без активации клеток. Это достигается путем предварительного забора сырых 2 6 4 0,7 клеток из исходного планшета с помощью щадящего пипетирования и посева клеток в 24-луночный планшет, обработанный тканевой культурой. Вторым шагом является трансфекция люциферазного сообщения Firefly о плазмиде, и контрольная группа запустила плазмиду люциферазы в клетки.

Эти плазмиды должны быть свободны от эндотоксинов. Затем клетки стимулируют желаемыми методами лечения, за которыми следует лизис клеток и перенос в белую 96-луночную пластину с прозрачным дном. Последним шагом является анализ активности люциферазы светлячков, а затем запуск активности люциферазы для расчета соотношения светлячков к соотношению.

В конечном счете, изменение кратности по сравнению с нестимулированным контролем используется для демонстрации влияния стимулов на репортер Люцифера, который коррелирует с уровнем экспрессии интересующего гена. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как обычная ночная транссекция, заключается в том, что клетки трансекты поддерживаются в состоянии покоя с минимальным повреждением клеток. ДНК пледа, которая должна была быть использована для трансфекции, была предварительно экстрагирована с помощью коммерчески доступного набора для подготовки макси и повторно суспендирована в 500 микролитрах буфера.

Поскольку наличие компонента клеточной стенки бактерии липополисахарид или ЛПС препятствует трансфекции, остаточные бактериальные загрязнения должны быть удалены из ДНК в вытяжном шкафу. Добавьте 500 микролитров фенилхлороформа изоамилового спирта в плазмидную ДНК и энергично встряхивайте в течение 15 секунд. Будьте осторожны, потому что фенол вызывает сильные ожоги кожи.

Инкубируйте смесь в течение пяти минут центрифугой при комнатной температуре при 13 000 умноженных на G в течение 10 минут при комнатной температуре, переливая 350 микролитров верхней водной фазы в новую сборную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Добавьте 350 микролитров TE-буфера в пробирку, содержащую нижнюю органическую фазу. Энергично встряхивайте в течение 15 секунд.

Центрифугируйте при 13 000 умноженных на G в течение пяти минут. При комнатной температуре переложите 350 микролитров верхней водной фазы в ту же 1,5-миллилитровую сборную пробирку. Добавьте 70 микролитров раствора ацетата натрия и хорошо перемешайте.

Добавьте 700 микролитров 100% изопропанола. Хорошо перемешайте и инкубируйте в течение 10 минут центрифугу комнатной температуры при 13 000 г в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Удалите супинат и добавьте 500 микролитров 75%-ного этанола в гранулу Вихревой образец перемешайте и центрифугируйте при 5 000 раз больше г в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия, удалите надосадочную жидкость.

ДНК плазмиды находится в грануле. Откройте крышку тюбика и высушите гранулу комнатной температуры на воздухе в течение пяти-10 минут. Гранула должна стать полупрозрачной.

Добавьте 500 микролитров TE-буфера в гранулу ДНК и нагревайте при температуре от 50 до 60 градусов Цельсия в течение 10 минут, чтобы растворить гранулу ДНК. Наконец, измерьте поглощение суспензии ДНК на 260 нанометрах и 280 нанометрах с помощью спектрометра. Для расчета концентрации ДНК и оценки ее качества сырые 2 6 4 0,7 макрофагальные клетки затеняли в DMEM с добавлением 9% эмбриональной сыворотки теленка в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия, 5% углекислым газом и пропускали каждые два дня.

Во время каждого прохода заменяйте старые среды меньшим объемом свежих сред и отделяйте клетки от планшета с помощью щадящего непрерывного пипетирования семян. От 1,5 до 2 миллионов клеток на 10-сантиметровой тканевой культуре обрабатывают в качестве запаса в день трансфекции семени. 200 000 клеток на лунку.

В 24-луночном планшете в объеме 500 микролитров DMEM 9%FCS инкубируют клетки в течение четырех часов в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы начать эту процедуру, разогрейте реагент для трансфекции до комнатной температуры в темноте, прогрейте сыворотку без среды и DMEM 9% FCS до 37 градусов Цельсия. Добавьте 0,5 мкг плазмидной ДНК к 50 микролитрам свободной сыворотки среды в пробирке объемом 1,5 миллилитра.

Добавьте два микролитра реагента для трансфекции с помощью наконечника пипетки под поверхность жидкого вихря на шесть секунд. Оставьте смесь реагента ДНК в темноте при комнатной температуре на 30 минут. Во время 30-минутной инкубации извлеките среду из лунок 24-луночного планшета и добавьте в каждую по 250 микролитров свежего DMEM 9%FCS.

Ну и верните тарелку в инкубатор через 30 минут. Добавьте 250 микролитров DMEM 9%FCS в смесь ДНК реагента и хорошо перемешайте, очищая вверх и вниз, добавьте по 300 микролитров разведенной смеси в каждую лунку 24-луночного планшета, инкубируйте в течение двух-четырех часов в инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. Через два-четыре часа удалите трансфекционный раствор и добавьте 500 микролитров DMEM 9% FCS и инкубируйте от 24 до 48 часов в инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия.

Начинают эту процедуру с разогрева сыворотки без среды и DMEM 9% FCS до 37 градусов Цельсия. Добавить 0,75 мкл реагента для трансфекции к 18,75 мкл сыворотки свободной среды вихрь, кратковременно перемешать и выдерживать комнатной температуры в течение пяти минут. Далее добавьте 0,5 микролитра раствора ДНК в соотношении один микрограмм на миллилитр в разведенный реагент для трансфекции при инкубации комнатной температуры в течение 10 минут.

Во время 10-минутной инкубации удалите среду из каждой лунки 24-луночного планшета и добавьте 250 микролитров свежего DMEM 9%FCS в каждую лунку через 10 минут. Добавьте 250 микролитров DMEM 9%FCS в смесь ДНК реагента. Добавьте 270 микролитров разведенной смеси в каждую лунку 24-луночного планшета для инкубации в течение двух-четырех часов в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом.

Через два-четыре часа удалите раствор для трансфекции и добавьте в каждый по 500 микролитров DMEM 9%FCS. Хорошо инкубируйте от 24 до 48 часов в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и процентом углекислого газа. Через 24-48 часов после трансфекции клетки могут быть стимулированы и проанализированы на активность люциферазы.

Замените среду в каждой лунке на 250 высвобождений свежего DMEM 9%FCS Добавьте в лунки 50 микровыбросов ЛПС или ЛПС плюс противовоспалительный цитокин ИЛ 10 в желаемых концентрациях. Верните тарелку в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия, стимулируйте от двух до шести часов. Далее удаляют раствор для стимуляции путем аспирации.

Промойте клетки ледяным PBS и добавьте в каждую по 200 микролитров одного буфера пассивного лизиса. Ну и покачиваем тарелку при комнатной температуре в течение 30 минут. Через 30 минут соскребите и перенесите лизат в пробирки объемом 1,5 миллилитра и удалите клеточный мусор путем центрифугирования при 20 000 раз.

G в течение 10 минут четыре градуса Цельсия. Перелейте 40 микролитров прозрачного лизата в белый прозрачный цвет. Нижняя 96-луночная пластина измеряет сигнал Люцифера с помощью люминометра по всему видимому световому спектру.

Согласно протоколу производителя, анализ низкой цитометрии клеток, трансфицированных плазмидой, экспрессирующей GFP, показал, что реагент на основе липидов дает скорость трансфекции около 25%, в то время как трансфекция на основе белка полиамида приводит к скорости около 5%. Добавление ЛПС усиливало сигнал люциферазы светлячков. Как правило, клетки совместно трансфицируют контрольной плазмидой, содержащей ген люциферазы РАН, и сигналы люциферазы светлячка нормализуются до сигнала люциферазы РАН.

Сравнение нормализованных сигналов между необработанными и обработанными образцами показало, что ЛПС усиливает, активность промоторного репортера и ИЛ 10 ингибирует эффект ЛПС. Сравнение продолжительности времени отдыха между трансфекцией и стимуляцией показало, что сигналы люциферазы со временем уменьшаются, что влияет только на интерпретацию данных. При использовании реагента для трансфекции на основе полиаминов для оценки влияния каждого метода трансфекции на клетки гибели клеток окрашивали аннексином 5 и йодидом пропидиума и анализировали только с помощью проточной цитометрии.

При трансфекции на основе липидов незначительно увеличивалась доля аннексина пяти положительных клеток. Иммуноблаттинг показал, что при трансфекции на основе липидов незначительно увеличивается доля расщепленного белка поли-рибозы-полимеразы DP. В то время как белковой поли на основе трансфекции не делали.

Несмотря на повышенное количество апоптотических клеток, морфология клеток при световой микроскопии не изменилась. Что еще более важно, биологический ответ трансфицированных клеток на основе липидов оставался идентичным таковому у нерезецированных клеток, которые производили одинаковое количество TNF альфа в ответ на ЛПС и ингибировались добавлением IL 10. Альфа-ФНО не вырабатывался, когда клетки не стимулировались, что позволяет предположить, что клетки остаются наивными после трансфекции.

После промывки этого видео пользователь получил хорошее представление о том, как транслировать необработанные 2 6 4 0,7 клетки с Люцифером в плазму минимально инвазивным способом, который не изменяет нативный ответ клеток.