Генерация рекомбинантного человеческого IgG моноклональных антител из иммортализованных клеток Сортировка В

Общая цель данной процедуры заключается в клонировании и экспрессии антител, вырабатываемых B-клетками. Это достигается путем предварительного выделения B-клеток из соответствующей ткани-источника, такой как кровь или тимус. Вторым этапом является проведение FACS-сортировки и отбор популяции B-клеток, положительных по продукции IgG.

Затем клетки иммортализируют путем инфицирования вирусом Эпштейна — Барр совместно с активацией Toll-подобного рецептора 9 с помощью C-P-G-O-D-N 2006 и поддерживают в культуре. Заключительные этапы включают выделение РНК из клонов, давших положительный результат на продукцию IgG по методу ИФА, и синтез копий ДНК как легких, так и тяжелых цепей IgG. В конечном итоге последовательности IgG можно клонировать в экспрессионные векторы для млекопитающих для получения больших количеств моноклонального человеческого IgG.

Главным преимуществом этого метода по сравнению с существующими, такими как технология фагового дисплея, является сохранение исходного спаривания тяжелых и легких цепей IgG. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области аутоиммунитета, такие как поиск и функциональная характеристика патогенных аутоантител. Не забывайте, что работа с материалом пациентов и вирусом EBV может быть сопряжена с риском.

Вирус EB является патогеном человека, поэтому при выполнении данных этапов всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в условиях BSL-2 и использование соответствующих средств индивидуальной защиты. Перед окрашиванием PBMC высейте их в колбу объемом 25 см³ с 6 мл полной среды RPMI 1640 и оставьте для восстановления на ночь. После блокировки и промывки клеток соберите PBMC в пробирку с 0,5 мл среды и центрифугируйте их. Затем ресуспендируйте клетки в буфере для маркировки и проведите их подсчет.

Затем подготовьте две пробирки для FACS, содержащие по 5 миллионов клеток в 200 µL буфера. Добавьте в эти пробирки 10 µL анти-CD22 P-E-R-C-P или 40 µL анти-IgG PE и инкубируйте их в течение 30 минут на льду в темноте, после чего промойте, отфильтруйте и отсортируйте клетки. Целью является подсчет дважды положительных клеток.

Начните с разведения отсортированных P BMC в концентрации одна клетка на микролитр в среде RPMI 1640 — полной среде с добавлением C PG 2006 и EBV. Затем в ламинарном шкафу внесите по 110 µL разведения клеток с EBV и CPG 2006 в две лунки 96-луночного планшета с круглым дном, в которые предварительно были высеяны облученные клетки WI 38. Инфицирование из расчета 50 клеток на лунку является оптимизированным и повышает вероятность получения моноклональных антител.

Тем не менее, мы рекомендуем подтвердить это с помощью ПЦР. После одной недели инкубации осмотрите клетки под микроскопом на предмет роста B-клеток. Через две недели замените среду: медленно аспирируйте 90 µL среды из каждой лунки и перенесите ее в новый планшет.

Для проверки продукции IgG методом ELISA добавьте в каждую лунку по 100 µL свежей дополненной среды, содержащей IL-2. Продолжайте мониторинг роста клонов в течение третьей и четвертой недель культивирования.

Повторяйте замену среды каждую неделю. Методы клональной экспансии описаны в текстовом протоколе. Проверяйте супернатанты, полученные после замены среды, на продукцию IgG с помощью иммуноферментного анализа (ELISA).

Сначала подготовьте планшеты для ИФА, дозировав в каждую лунку по 50 µL антител козьих к Fc-фрагменту человеческих антител, разведенных в кодирующем буфере в соотношении 1:200. После инкубации и промывки планшета заблокируйте лунки, добавив в каждую по 100 µL блокирующего буфера, и снова проинкубируйте планшет. После инкубации для блокировки удалите жидкость из планшета, вылив ее на бумажное полотенце.

После подготовки планшета разбавьте супернатанты четырехкратным объемом среды RPMI. Затем для стандартного контроля проведите серийное разведение раствора IgG человека в среде RPMI в диапазоне от 1000 nanograms per milliliter до 15.6 nanograms per milliliter.

Также включите холостую пробу. Внесите по 50 µL супернатанта или стандарта в каждую лунку и инкубируйте планшет для ELISA в течение одного часа при 37 °C аналогичным образом; для анализа дальнейших разведений супернатантов с целью проверки аффинности антител можно подготовить дополнительные планшеты ELISA. После инкубации промойте планшет.

Затем в каждую лунку внесите 50 µL инкубационного буфера с перoxidase-конъюгатом fab two. После еще одного часа инкубации и повторной промывки добавьте в каждую лунку 100 µL раствора субстрата с TMB. Затем инкубируйте планшет до 10 минут, пока не стабилизируется появившийся синий цвет.

Затем остановите реакцию и измерьте абсорбцию. Супернатанты клонов, измеренная абсорбция которых превышает значение холостой пробы на три стандартных отклонения, считаются положительными.

Для антител IgG человека антигенную специфичность можно определить с помощью дополнительных анализов. Сначала следуйте текстовому протоколу для синтеза копий ДНК из положительных клонов. Затем проведите ПЦР для тяжелых, каппа- и лямбда-цепей IgG.

В результатах определите тяжелую цепь в диапазоне от 400 до 550 пар оснований. Определите легкую цепь в диапазоне от 300 до 400 пар оснований. Если они отсутствуют, используйте один микролитр продуктов в качестве матрицы для повторного ПЦР.

Новые продукты должны находиться в соответствующем диапазоне. Затем приступайте к клонированию лучших продуктов. Сначала проведите их секвенирование. Их электрофореграммы должны быть чистыми и соответствовать одной последовательности иммуноглобулина.

Следуя текстовому протоколу, клонируйте очищенный ПЦР-продукт в микрограмм плазмидной ДНК. Обязательно проведите лигирование в течение ночи при 16 °C.

Используя T4 ДНК-лигазу, подготовьте клетки HX в дополненной среде DMEM и выращивайте их до 75% конфлюэнтности в культуральных колбах объемом 75 квадратных сантиметров. Для каждой трансфекции тяжелой и легкой цепей подготовьте смесь, содержащую 1,75 Milliliters среды DMEM без сыворотки, 4,5 micrograms вектора тяжелой цепи, три micrograms вектора легкой цепи и 50 microliters раствора полиэтилена. Осторожно добавьте эту смесь к плашке с клетками HX и перемешайте раствор круговым движением по всей поверхности плашки.

Инкубируйте планшет в течение ночи, после чего приступайте к ежедневному сбору культуральной среды, заменяя её средой без сыворотки. Среда содержит антитела; её можно собирать ежедневно в течение четырех дней после окрашивания, когда CD 22 и IgG-положительные pBMC были отсортированы методом FACS.

Фракция дважды положительных клеток — B-клеток, вырабатывающих антитела IgG, — была собрана отдельно для экспансии. Примерно 1% PBMC принадлежали к этой дважды положительной популяции. После пяти недель стимуляции EBV и CPG 2006 были выделены иммортализованные клоны.

Клетки-фидеры WI 30 имеют более вытянутую фибробластоподобную форму, а клоны В-клеток выглядят как очень маленькие круглые клетки, растущие скоплениями в центре многолуночного планшета с круглым дном. Супернатант растущих клонов анализировали с помощью ИФА на наличие IgG. Положительным клоном считался тот, значение которого превышало значение холостой пробы на три стандартных отклонения.

По крайней мере три супернатанта от позитивного клона дали положительный результат в ЭЛИФА. Антитела от позитивного клона были секвенированы после клонирования; в результате удалось охарактеризовать вариабельные и константные области пары тяжелой и лямбда-цепей иммуноглобулина. После выполнения данной процедуры.

Для ответа на дополнительные вопросы, такие как использование антител и генов, генетическое разнообразие и так далее, могут быть применены другие методы, например секвенирование. После разработки эта методика открыла исследователям в области аутоиммунитета возможность изучать механизмы развития, патологию и соответствующие терапевтические стратегии лечения аутоиммунных заболеваний, таких как миастения гравис. Значение этой методики распространяется на диагностику и терапию таких заболеваний, как миастения гравис, поскольку обнаружение патогенных антител может привести к разработке новых методов лечения, например, созданию конкурирующих антител, лишенных воспалительной активности.