Альгинат инкапсуляции плюрипотентных стволовых клеток, используя коаксиальный Насадка

Общая цель этой процедуры заключается в безопасном и эффективном встраивании стволовых клеток в альгинатные, гидрогелевые капсулы, а также в культивировании их внутри капсул для контроля Для агрегации и микроокружения это достигается путем предварительного смешивания отфильтрованной суспензии стволовых клеток и раствора альгината натрия. Затем смесь переливается в шприц и на шприц устанавливается коаксиальная насадка перед их установкой на шприцевой насос. Затем капли подготавливаются путем вытеснения клеточной суспензии с сопутствующим газообразным азотом, после чего следует сбор и раствор хлорида кальция.

Затем капсулы обрабатывают поли-L лизином для предотвращения утечки клеток и ЭДТА для псевдоожижения внутренних капсул перед культивированием инкапсулированных клеток в условиях ротационного встряхивания. Наконец, клетки собираются из капсул с помощью ЭДТА и физического разрушения мембраны. В конечном счете, альгинатная инкапсуляция плюрипотентных стволовых клеток предотвращает чрезмерную агрегацию клеток и ограничивает чистый стресс, испытываемый клетками в суспензионной культуре.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в биологической и биомедицинской области, такие как большая экспансия трансплантации клеток и исследования ниши стволовых клеток. Начните инкапсуляцию клеток со сбора клеток, как описано в текстовом протоколе, после центрифугирования при 160-кратном G в течение трех минут. Индуцированную плюрипотентную стволовую или IPS-клеточную гранулу промывают Ресусом, суспендируя в кучах буферный физиологический раствор и центрифугируя трижды после ресуссипи, суспендируя клетки и кучи буферного физиологического раствора.

Отфильтруйте суспензию ячеек через сетчатый фильтр 40 микрон, чтобы удалить крупные заполнители, которые в противном случае могли бы засорить сопло. Далее смешайте два миллилитра отфильтрованной клеточной суспензии и три миллилитра 5%-ного раствора альгината натрия. Для получения пятимиллилитровой клеточной суспензии в 3% альгината натрия плотность клеток составляет DIR более 1 миллиона клеток на миллилитр.

Собрав клеточную суспензию в пятимиллилитровый шприц, установите на шприц коаксиальную насадку и установите их на шприц-насос, выпустите поток газообразного азота через наружную иглу коаксиальной насадки и вытесните клеточную суспензию через внутреннюю насадку. Соберите капли в 250 миллилитров 0,5% раствора хлорида кальция и подождите от 10 до 20 минут для созревания, помешивая при 60–90 оборотах в минуту. После промывки с кучей буферизованным физиологическим раствором, собранные капсулы утилизируют в виде голых капсул для обработки капсул инкубации альгината кальция в 0,05% от массы на объем.

Поли Л раствор лизина в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе с встряхиванием. Собрав капсулы в пробирку и промыв кучей буферным физиологическим раствором, инкубируйте их в DMEM, содержащем 10% FBS. Чтобы нейтрализовать электрический заряд на их поверхности, используйте полученные капсулы в качестве капсул с покрытием для создания полых капсул.

Инкубируйте капсулы в кучах с буферным физиологическим раствором, содержащим 10 миллимоляров ЭДТА, в течение пяти минут. Капсулы, обработанные ЭДТА, используются в виде полых капсул. Инкубируйте инкапсулированные клетки при 75 об/мин с встряхиванием при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 10 дней после инкубации, соберите и инкубируйте капсулы в 10 миллимолярных ЭДТА при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе в течение 10 минут.

Соберите клетки из альгинатных капсул без обработки поли-ллицином путем центрифугирования при 1000-кратном G в течение трех минут. Если альгинатные капсулы обрабатываются поли-L лизином, разорвите мембрану альгината поли-L лизина, пипетируя вверх и вниз около 10 раз иглой, прикрепленной к шприцу. Диаметр иглы должен быть меньше размера капсулы, и в этом эксперименте используются иглы 25 калибра.

После центрифугирования при 1000-5000 G в течение пяти минут соберите клеточную гранулу строго из разрушенных альгинатных поли-L-лициновых мембран. Если образцы мРНК собраны из клеток, обратите внимание, что оставшиеся альгинатные поли-L-лициновые мембраны могут препятствовать очистке мРНК, как это визуализируется высокоскоростной камерой. Выброшенный раствор альгината сразу после изгнания приобретает сферическую форму. Если суспензия вытесняется со скоростью расхода азота менее одного литра в минуту, размер капель получается равномерным.

Однако, если поток азота превышает один литр в минуту, капля разрушается, и размер капель становится неоднородным. Учитывая это, с помощью этого метода сложно приготовить капли размером менее 500 мкм. В процессе желирования капли альгината натрия образуют капсулы альгината кальция сферической формы в растворе хлорида кальция.

Если концентрация альгината натрия достаточно высока, то низкая концентрация альгината натрия приводит к образованию капсул nons, spherical и nonoo, что вызывает проблемы в процессе кодирования. Даже если концентрации альгината натрия недостаточно, за счет увеличения концентрации кальция могут образоваться сферические капсулы. Тем не менее, около 50 миллимоляров хлорида кальция подходит для инкапсуляции, потому что слишком высокая концентрация хлорида кальция снижает рост и жизнеспособность клеток.

Инкапсулированные клетки могут расти в капсулах, но клеточная утечка может происходить в капсулах без альгинатного покрытия из поли-L-лизина. В случае мышиных IPS-клеток клетки образуют дискообразные агрегаты в каждой капсуле альгината кальция, в то время как клетки слипаются и образуют одиночные сферические агрегаты в каждой полой капсуле. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как инкапсулировать и культивировать клетки для контроля размера.

Водород улавливается без какого-либо специального оборудования, без органического абсорбента.