Одноканальный анализ и Кальций изображений в подоцитов в Свежевыделенные клубочков

Общая цель данной процедуры заключается в измерении изменений внутриклеточной концентрации кальция в ответ на воздействие фармакологических агентов. Оцените базальные уровни кальция и активность отдельных каналов в подоцитах в составе всего свежевыделенного клубочка. Это достигается путем предварительного удаления крови из почек крысы путем промывания через брюшную аорту.

Затем извлекают почки, изолируют корковое вещество почки и измельчают его лезвием бритвы. На третьем этапе проводят выделение кортикальных клубочков методом дифференциального центрифугирования. После этого изолированные отделенные клубочки можно либо использовать для электрофизиологических экспериментов, либо нагрузить флуоресцентными красителями для последующего измерения концентрации кальция методом конфокальной микроскопии.

В конечном счете, эти процедуры позволяют исследователям фиксировать острые изменения в регуляции внутриклеточного кальция в ответ на воздействие различных агентов, а также оценивать и модулировать кальциевую проводимость на уровне отдельных ионных каналов. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами является возможность изучения подоцитов как части целого изолированного клубочка. Наша препарация сохраняет функциональный потенциал подоцитов.

Они остаются прикрепленными к капиллярам и участвуют в гомеостазе среды, которая фактически позволяет сохранять основные части фильтрационного аппарата клубочков. Применение данного метода расширяет наш фармакологический скрининг. В нормальном и патологическом состояниях механизм регуляции обмена кальция в подоцитах играет важную регуляторную роль в развитии и предотвращении почечных осложнений при таких заболеваниях, как диабетическая нефропатия, фокально-сегментарный гломерулосклероз или гипертензия. Большое значение имеет наблюдение за реакцией притока кальция в этих клетках на лекарственные препараты, что позволяет легко проводить их скрининг.

В данной подготовке VLA Hunka продемонстрирует способ промывания почки для последующих процедур. Я покажу изоляцию гломерул и электрофизиологию V-зажима, а доктор GaN проведет вас через конфокальный кальциевый имиджинг. Для начала процедуры поместите анестезированную крысу на хирургический стол с контролем температуры. Под микроскопом сделайте срединный разрез брюшной стенки, чтобы обнажить нижнюю пололую вену и аорту.

Затем наложите лигатуру вокруг чревного ствола, верхней брыжеечной артерии и брюшной аорты выше них. Тупым способом препарируйте брюшную аорту ниже почечных артерий. Затем наложите на нее две лигатуры, но не затягивайте их.

Зажмите аорту выше лигатур и завяжите нижнюю нить. После этого катетеризируйте аорту с помощью полиэтиленовой трубки, подсоединенной к шприцевому насосу, заполненному PBS, ниже зажима, и зафиксируйте катетер второй лигатурой. Затем снимите зажим и перевяжите сосуды.

Определите энтеральные и чревные артерии. Промойте аорту предварительно охлажденным PBS в течение трех минут со скоростью 6 мл/мин. Одновременно с этим сделайте надрез в полой вене рядом с почечными венами для сброса давления.

Через три минуты остановите перфузию, извлеките и инкапсулируйте почки. Поместите их в раствор PBS на льду. Теперь приготовьте 30 мл свежего 5% BSA в среде RPMI 1640.

С помощью лезвия бритвы и ножниц выделите корковое вещество обеих почек, затем измельчите их до достижения однородности. Далее пропустите измельченную ткань через сито из нержавеющей стали с размером ячеек 100 меш, предварительно замоченное в 5% растворе P-S-A-R-P-M-I. Соберите фильтрат и пропустите его через сито с размером ячеек 140 меш.

Затем профильтруйте собранный фильтрат через предварительно смоченное сито с размером ячеек 200 mesh. Фильтрат удалите, а верхнее сито промойте от 10 до 15 миллилитров приготовленного раствора B-S-A-R-P-M-I, собрав гломерулы с поверхности сита. Далее перенесите раствор B-S-A-R-P-M-I, содержащий гломерулы, в 15-миллилитровую пробирку и оставьте гломерулы оседать на дно пробирки в течение 20 минут.

В данной процедуре покровные стекла размером 5×5 мм покрывают полилизином с молекулярной массой от 70 000 до 150 000 и высушивают на нагревательной плитке. Затем экспериментальные растворы доводят до комнатной температуры, заполняют камеру и пипетку для патч-клампа. Раствор, содержащий клубочки, осторожно перемешивают. После этого на каждое покровное стекло, покрытое полилизином, наносят примерно 50 µL этого раствора.

После этого перенесите стеклянные чипы с клубочками в камеру для патч-клампа, предварительно заполненную раствором Beth. Проводите перфузию камеры со скоростью 3 мл/мин в течение одной минуты, чтобы удалить все неприкрепленные клубочки, перед началом стандартной записи методом патч-клампа в конфигурации cell-attached.

Теперь поместите по 500 µL фракции клубочков в каждую коническую пробирку объемом 0,5 мл и добавьте кальциевые красители Pure Red AM и Fluo-4 AM. Затем поместите пробирки на ротационный шейкер максимум на один час при комнатной температуре. После этого подготовьте стеклянные покровные стекла с полилизином и дайте им высохнуть на нагревательной плите при 70 °C. По завершении загрузки кальциевых красителей нанесите 100 µL раствора, содержащего клубочки, на покрытые полилизином покровные стекла и оставьте их для прикрепления к поверхности примерно на пять минут.

Затем закрепите покровные стекла с прикрепленными клубочками в камере для визуализации и перфузируйте их банным раствором со скоростью 3 мл/мин, чтобы удалить неприкрепленные клубочки и остатки красителей. После этого установите длину волны возбуждения конфокального лазерного сканирующего микроскопа на 488 нм. Затем в программном обеспечении для визуализации установите желаемую частоту и разрешение.

Затем найдите клубочки в режиме светлого поля. После этого включите детектирование флуоресцентного сигнала. Затем выберите нужную фокальную плоскость и проверьте интенсивность флуоресценции в каналах flu oh four и firo red.

Убедитесь, что клубочек четко виден в светлом поле. Затем зарегистрируйте изменения интенсивности флуоресценции для сигналов flu oh four и furor red. Чтобы импортировать последовательность изображений, разделите каналы и используйте режим гиперстека в оттенках серого.

В программном обеспечении Image J откройте окно менеджера ROI (ROI manager), перейдя по пути Analyze > Tools > ROI Manager. Выберите одну или несколько областей интереса с помощью инструмента овального выделения (oval selection tool) и функции Add T в менеджере ROI. Затем выделите область на фоне и сохраните выбранные ROI.

Затем в диалоговом окне отметьте пункт «одна строка на срез» и нажмите «ОК» в окне параметров результатов. Перейдите к настройкам измерений. Выберите «среднее значение серого» (mean gray value) и рассчитайте значения интенсивности пикселей для каждого ROI; результаты будут отображены в окне результатов в отдельных столбцах.

Затем для каждого ROI скопируйте измеренные значения интенсивности ROI для каждого канала в подходящее программное обеспечение для анализа данных и вычтите значения интенсивности фона из каждой точки данных для каждого момента времени. Рассчитайте соотношение интенсивностей каналов flu oh four и URA red, после чего постройте график изменения кальциевых транзиентов во времени для каждого ROI. На этом изображении показана патч-кламп пипетка, прикрепленная к телу оксида на поверхности клубочка крысы.

Во время электрофизиологической регистрации в правом нижнем углу изображения видна часть инкапсулированного клубочка. Здесь представлен репрезентативный график тока активности TRP-подобных каналов, полученный с помощью метода patch-clamp (конфигурация cell-attached) на подоците для измерения внутриклеточной концентрации кальция. Клубочки нагружены красителем Fluo-4 AM для маркировки внутриклеточного кальция.

В данном видео демонстрируется влияние CIN и хлорида марганца на приток кальция в клубочках. На этом графике количественно представлены изменения интенсивности сигнала Fluo-4, зарегистрированные в отдельном подоците в ответ на воздействие CIN и хлорида марганца. Как и ожидалось, CIN вызывает максимальную флуоресценцию, а хлорид марганца гасит краситель, что приводит к самой низкой интенсивности флуоресценции.

Применение этих препаратов позволяет исследователю в дальнейшем определить точную концентрацию кальция внутри клетки. В данном видео демонстрируется влияние 10 micromole a TP на концентрацию кальция в клубочках. Обратите внимание на увеличение зеленой флуоресценции flu O four и снижение красной флуоресценции fu red, что свидетельствует о повышении внутриклеточной концентрации кальция.

Данный метод предоставляет уникальную возможность контролировать изменения притока кальция на уровне отдельных ионных каналов и единичных клеток после фармакологического воздействия или других манипуляций. Таким образом, этот подход представляет собой очень мощный инструмент с учетом множества доступных генетически модифицированных моделей грызунов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить измерения концентрации кальция в подоцитах, а также о том, как использовать электрофизиологические эксперименты с фиксацией потенциала как совместно с этим методом, так и самостоятельно.

Эти методы позволяют детально и на механистическом уровне изучить регуляцию обмена кальция в подоцитах при нормальных и патологических условиях.