Одноканальный анализ и Кальций изображений в подоцитов в Свежевыделенные клубочков

Общая цель этой процедуры заключается в измерении изменений внутриклеточной концентрации кальция в ответ на фармакологические агенты. Оценка базальных уровней кальция и оценка активности отдельных каналов в подоцитах как части целого вновь выделенного клубочка. Это достигается путем предварительного очищения почек крыс от крови путем промывания через брюшную аорту.

Затем почки собирают, изолируют кору головного мозга почек и измельчают с помощью бритвенного лезвия. На третьем этапе корковые клубочки изолируются с помощью дифференциального цингирования. После этого изолированные обезглавленные клубочки могут быть подвергнуты электрофизиологическим экспериментам или загружены флуоресцентными красителями и взяты для измерения конфокальной концентрации кальция.

В конечном счете, эти процедуры позволяют исследователям устранять острые изменения во внутриклеточном обращении с кальцием в ответ на применение различных агентов, а также оценивать и манипулировать проводимостью кальция на уровне одиночных ионных каналов. Основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в том, что она позволяет изучать подоциты в составе целого изолированного клубочка. Наш препарат сохраняет функциональный потенциал подоцитов.

Они остаются прикрепленными к капиллярам и участвуют в гомеостазе в окружающей среде, которая фактически может сохранить основные части фильтрационного аппарата клубочков. Применение этой методики расширяет наш фармакологический скрининг В нормальных и патологических состояниях механизм обработки кальция подоцитами играет важную регуляторную роль в развитии и профилактике почечных осложнений при таких заболеваниях, как диабетическая нефропатия, омерный склероз очагового сегмента или гипертензия. Очень важно наблюдать за реакцией притока кальция в этих клетках на лекарства, которые можно легко проверить.

В этом препарате VLA Hunka продемонстрирует, как правильно промывать почки для следующих процедур. Я покажу изоляцию клубочков и электрофизиологию V-образного зажима, а доктор GaN проведет вас через конфокальную визуализацию кальция. Чтобы начать эту процедуру, поместите крысу под наркозом на хирургический стол с регулируемой температурой Под микроскопом сделайте разрез по средней линии на животе, чтобы открыть вену CVA и аорту.

Далее введите лигатуру вокруг чревной и верхней брыжеечных артерий и брюшной аорты над ними. Тупыми, рассекаем брюшную аорту ниже почечных артерий. Затем поместите вокруг него две лигатуры, но не перевязывайте.

Зажмите аорту над лигатурами и завяжите нижнюю нижнюю нить. После этого катетеризируют аорту с помощью полиэтиленовой трубки, которая крепится к шприцевому насосу, наполненному PBS, ниже зажима и фиксируют катетер второй лигатурой. Затем снимите зажимы и переведите их.

Кишечные и чревные артерии. Наполните аорту предварительно охлажденным PBS в течение трех минут со скоростью шесть миллилитров в минуту. В это же время сделайте надрез в вене кавы возле почечных вен, чтобы сбросить давление.

Через три минуты прекратить перфузию, иссекать и инкапсулировать почки. Поместите их в раствор PBS на лед. Теперь приготовьте 30 миллилитров свежего 5% BSA в среде RPMI 1640.

С помощью бритвенного лезвия и ножниц изолируйте кору обеих почек, затем MIT до однородности. Затем пропустите измельченную салфетку через сито из нержавеющей стали с плотностью 100 меш, предварительно замоченное в 5% растворе P-S-A-R-P-M-I. Соберите поток и дайте ему пройти через 140 меш

Затем отфильтруйте собранный поток через сито 140 меш с помощью предварительно замоченного 200 меш сив. Выбросьте фильтрат и промойте верхнее сито от 10 до 15 миллилитров приготовленного раствора B-S-A-R-P-M-I и соберите клубочки с верхней части сита. Затем поместите раствор B-S-A-R-P-M-I, содержащий G Glomeruli, в 15 миллилитров, два бон льда и дайте клубочкам отстояться на дне пробирки в течение 20 минут.

В ходе этой процедуры покройте пятью на пять миллиметровых крошек покровного стекла с молекулярной массой от 70 000 до 150 000 полилизина и высушите их на нагретой пластине. Далее прогрейте экспериментальные растворы до комнатной температуры и заполните патч зажимной камерой и пипеткой. Аккуратно перемешайте клубочки, содержащие раствор. Затем нанесите примерно 50 микролитров его на каждый скол покровного стекла, покрытый полилизином.

После этого переместите стеклянную крошку с клубочками в камеру патч-хомута. Предварительно заполнен раствором Бет. Перфузируйте камеру со скоростью три миллилитра в минуту в течение одной минуты, чтобы удалить все неприкрепленные клубочки, прежде чем проводить обычную запись патч-зажима в режиме прикрепленной клетки.

Теперь поместите 500 микролитров фракции клубочков в каждую 0,5-миллилитровую коническую трубку и добавьте кальциевые красители pure red am и flu oh 4:00 AM. Затем поместите трубки на вращающийся шейкер на срок до одного часа при комнатной температуре. Затем подготовьте стекла для стекла стекла с полилизином и дайте им высохнуть на нагретой плите при температуре 70 градусов Цельсия. После того, как загрузка кальциевых матриц будет завершена, нанесите 100 микролитров раствора, содержащего клубочки, на покрытые полилизином покровные стекла и дайте им прилипнуть к поверхности примерно на пять минут.

Затем закрепите клубочки на прилагаемой крышке стебля на камеру для визуализации и перфузируйте их раствором для ванны со скоростью три миллилитра в минуту для удаления неприкрепленных клубочков и остатков красителей. После этого установите конфокальный лазерный сканирующий микроскоп на волну возбуждения 488 нанометров. Затем установите программное обеспечение для обработки изображений на нужную частоту и разрешение.

Далее найдите клубочки в светлом поле. Впоследствии включите детектирование сигнала флуоресценции. После этого выберите нужную фокальную плоскость и проверьте интенсивность флуоресценции на грип о четыре и фиро красных каналах.

Убедитесь, что клубочек хорошо виден в светлом поле. Затем запишите изменения интенсивности флуоресценции для сигналов гриппа и красного цвета. Чтобы импортировать последовательность изображений, разделите каналы и используйте режим оттенков серого hyper stack.

В программном обеспечении Image J откройте окно менеджера ROI, следуя по пути инструментов анализа, пути к менеджеру ROI. Выберите одну или несколько областей интереса с помощью инструмента выбора овала и функции добавления T в менеджере ROI. Затем выберите область на заднем плане и сохраните выбранные ROI.

Затем отметьте поле «Одна строка для каждого среза» в диалоговом окне и нажмите «ОК» в меню «Результаты». Установите мерки. Выберите среднее значение серого и рассчитайте значения интенсивности пикселей для каждого ROI, которые будут отображаться в окне результатов в отдельных столбцах.

Затем для каждого ROI скопируйте измеренные значения интенсивности ROI для каждого канала в предпочитаемое программное обеспечение для анализа данных и вычтите значения фоновой интенсивности из каждой точки данных для каждой временной точки. Рассчитайте отношение интенсивностей гриппа oh four к красным каналам URA после этого графика, точечные временные изменения переходного процесса кальция для каждого ROI. На этом изображении показана пипетка с патч-зажимом, прикрепленная к оксидному телу на поверхности клубочка крысы.

Во время электрофизиологической записи часть инкапсулированного клубочка может быть видна в правом нижнем углу изображения. Вот репрезентативный текущий след активности трип-подобных каналов от прикрепленного к клетке пластыря, сделанного на подоците для измерения внутриклеточной концентрации кальция. Клубочки нагружают гриппом в 4:00 утра для маркировки внутриклеточного кальция.

Это видео иллюстрирует влияние ЦИН и хлорида марганца на приток кальция в клубочки. Этот график количественно оценивает изменения интенсивности сигнала гриппа или четырех сигналов, зарегистрированных от одного подоцита в ответ на ЦИН и хлорид марганца. Как и ожидалось, CIN производит максимум флуоресценции, а хлорид марганца гасит краситель и приводит к самой низкой интенсивности флуоресценции.

Применение этих препаратов позволяет в дальнейшем точно определить концентрацию кальция в клетке. В этом видео демонстрируется влияние 10 микромолей ТП на концентрацию кальция в клубочках. Следует отметить, что наблюдается увеличение флуоресценции зеленого гриппа О-4 и снижение красной фу-красной флуоресценции, что объясняет увеличение внутриклеточной концентрации кальция.

Эта методика дает уникальную возможность отслеживать изменения притока кальция на уровне отдельных ионов и отдельных клеток после фармакологического лечения или других манипуляций. Таким образом, такой подход представляет собой очень мощный инструмент, учитывая множество доступных генетически модифицированных моделей грызунов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить измерения кальция в подоцитах организма, а также электрофизиологические, которые зажимают эксперименты, используемые в совокупности сами по себе.

Эти методы обеспечивают глубокое и механистическое понимание регуляции обработки кальция с подоцитами в норме и при патологии.