Живая съемка в эпендимных ресничек боковых желудочков головного мозга мыши

Общая цель данной процедуры — обеспечить наблюдение ex vivo за сокращениями Motr append CLIA, расположенного в желудочках головного мозга мыши. Для этого сначала извлекают весь головной мозг, а затем получают тонкие срезы через боковые желудочки. Затем срезы инкубируют в специализированном планшете с стеклянным дном, содержащем среду с высоким содержанием глюкозы при температуре тела, чтобы поддерживать жизнеспособность ткани в ходе эксперимента.

Наконец, биение ресничек регистрируют с помощью дифференциально-интерференционного микроскопа высокого разрешения. В конечном итоге структуру и локализацию белков в ресничках можно визуализировать с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Основное преимущество данного метода по сравнению с нашим существующим подходом заключается в том, что это первая методика, позволяющая классифицировать эпидермальные клетки по трем отдельным группам на основе их уникальных частот и углов биения ресничек.

Это хороший результат. Применение данного метода открывает возможности для терапии гидроцефалии, поскольку нарушение функции эпидермальных CLIA приводит к накоплению спинномозговой жидкости в головном мозге.

Желудочки. Процедуру демонстрируют г-жа Заха Алам и г-жа Ханна, очень талантливые студенты нашей лаборатории. Начните с очистки головы взрослой мыши 70% ethanol. Затем, начиная с макушки, с помощью стерильных ножниц и пинцета удалите кожу, чтобы обнажить череп.

Затем проведите заживление кости по частям, начиная с задней стороны и перемещаясь к передней. Чтобы извлечь череп, выделите весь мозг и поместите его в чашку Петри диаметром 100 миллиметров со средой с высоким содержанием глюкозы при температуре 37 °C. С помощью острого лезвия разрежьте мозг по срединной сагиттальной плоскости, чтобы получить первый срез толщиной от 100 до 200 микрон из каждой половины.

Затем промойте срезы в PBS при 37 °C и немедленно поместите ткань в среду с высокой концентрацией глюкозы при 37 °C. Для получения изображений срезов поместите срезы мозга в стеклянные культуральные чашки с дном диаметром 30 мм, содержащие 1 мл среды с высокой концентрацией глюкозы, и настройте параметры среды в закрытой камере микроскопа на 37 °C и 5% carbon dioxide, используя иммерсионный объектив 60x. Затем сфокусируйтесь на клетках, используя обычный проходящий дифференциально-интерференционный контраст (DIC).

Затем, следуя за направлением движения пузырька DMEM, определите местоположение подвижных эпипендумных клеток (ependymal cilia). Используйте фильтр DIC, чтобы выбрать область, содержащую здоровые клетки с подвижными ресничками в боковом желудочке головного мозга. После обнаружения эпипендумных клеток отрегулируйте освещение и фокус для получения удовлетворительного изображения.

Затем установите параметры живой визуализации в программном обеспечении для имиджинга. Например, в данном случае регистрируются 24-битные изображения с биннингом камеры 1×1 при использовании объектива 60x и временем экспозиции от 5 до 10 мс. Откройте апертуру микроскопа до оптимального уровня для обеспечения минимального времени экспозиции и получите DIC-изображения.

Наблюдайте за изображениями в режиме реального времени, передаваемыми на камеру, чтобы обеспечить быстрый и незамедлительный захват кадров без задержки. Затем можно рассчитать скорость сокращения на основе требований к минимальному времени экспозиции для получения достаточного контраста изображения для регистрации кальциевого сигналинга. После нарезки мозга коротко промойте ткань в PBS и немедленно инкубируйте срезы в 20 µg/mL свежеприготовленного lu O2 в планшете со стеклянным дном.

После 30 минут при 37 °C запишите осцилляции кальция с частотой захвата пять миллисекунд в течение минимум одной секунды. Сначала при длине волны возбуждения 488 нм, затем при длине волны эмиссии 515 нм. Для визуализации интересующих клеточных маркеров с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии зафиксируйте образцы в 4% параформальдегиде и 2% сахарозе в PBS в течение 10 минут.

Промойте ткань трижды в PBS по пять минут за каждую промывку. Затем инкубируйте срезы мозга в 0,1% Triton X в течение пяти минут. После промывки образцов, как было только что продемонстрировано, инкубируйте их с антителами мыши к ацетилированному альфа-тубулину.

После еще одной промывки PBS инкубируйте образцы с флуоресцентными антителами к IgG против US в течение одного часа при комнатной температуре. В завершение проведите контрастирование срезов красителем DPI в течение пяти минут и немедленно получите изображения клеток при минимально возможном времени экспозиции. Наличие пенального CLIA подтверждается с помощью цилиарного маркера ацетилированного альфа-тубулина с контрастированием DPI. Для идентификации ядер анализ потока мотильности пенального CLIA осуществляется путем подсчета частоты биения и анализа паттернов углов движения клеток.

Затем CLIA можно разделить на одну из трех групп на основе этих данных. Важно отметить, что воздействие 0.25%Ethanol значительно подавляет частоту биений CLIA независимо от их типа. Дальнейший изгиб CLIA запускает зависимый от реснитчатого аппарата внутриклеточный кальциевый сигнал, что позволяет измерять сигнал внутриклеточного кальция в желудочках мозга. После освоения эта методика может быть выполнена за один час при условии правильного проведения процедуры.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости бережного и оперативного обращения с тканью мозга, чтобы не повредить желудочки мозга после их формирования. Этот метод открыл исследователям в области нейробиологии возможность изучать функции append CLIA и живой ткани мозга мыши.