Создание и характеристика ИМП и CAUTI в мышиной модели

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать надежный метод установления инфекций мочевыводящих путей или ИМП и катетер-ассоциированных ИМП, или ca ИМП I на мышиной модели, а также оценить инфекции. Это достигается путем правильной подготовки бактериальных инокулятов, катетера и иглы. Затем мочевыводящие пути мыши внутрипузырно вводятся, прививаются и катетеризируются.

Затем забор тканей мочевыводящих путей и катетеров для оценки инфекции. Наконец, инфекцию количественно оценивают путем определения бактериальной ткани, мочи и нагрузки на катетер и/или образования внутриклеточного бактериального сообщества или IBC. В конечном счете, подсчет КОЕ и слабое окрашивание используются для демонстрации стойкости и тяжести колонизации мочевыводящих путей в мышиной модели.

Основное преимущество этой методики заключается в разработке надежной модели для имитации ИМП человека с целью выявления критических этапов патогенеза ТИ. Эта модель помогла в разработке новых методов лечения и терапии ИМП. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку инокуляцию, изационизацию и оценку внутриклеточных бактериальных сообществ трудно освоить, поскольку манипуляции с уретрой и тканями мочевого пузыря не являются интуитивно понятными.

Для начала проденьте примерно один дюйм трубки PE 10 на вал иглы 30 калибра. УФ-излучение стерилизовать в течение ночи и подготовить бактериальный посевной материал. Согласно текстовому протоколу на стерилизованном рабочем месте наберите до 0,9 миллилитра приготовленного бактериального посевного материала в одномиллилитровый шприц.

Приложите к шприцу подготовленную стерильную иглу для инокулята с полиэтиленовой трубкой, а стерильными ножницами обрежьте трубку до одного миллиметра в длину. После обезболивания самки мыши согласно текстовому протоколу положите ее на спину на бумажное полотенце и раздвиньте ножки. Прикрепите к мыши носовой конус и обеспечьте контролируемую подачу изофтора.

Осторожно пальпируйте мочевой пузырь, чтобы вызвать мочеиспускание, и избегайте мочевого пузыря, а также используйте салфетку со 100% этанолом для очистки периуретральной области. Сначала промокните острие шприца с иглой для инокуляции в хирургическую смазку. Затем введите иглу для посева в уретру примерно на 12 миллиметров и осторожно нажмите на поршень шприца, чтобы выдать 50 микролитров бактериального раствора в блюдо.

Чтобы собрать мочу до или после заражения, осторожно удерживайте мышь, держа ее за хвост и положив его на плоскую возвышенную поверхность, например, на верхнюю часть клетки для мыши. Подложите стерильную трубку объемом 1,5 миллилитра под уретру мыши и осторожно надавите на спину мыши возле хвоста, чтобы оказать давление на мочевой пузырь. Поймайте мочу в трубку.

После подготовки серийного разведения мочи и культивирования в течение ночи подсчитайте колонии для выполнения протокола C-A-U-T-I. Начните с вырезания семимиллиметрового куска трубки из полиэтилена 10 и пятимиллиметрового куска силиконовой трубки, такой как рейл. Снимите колпачок иглы 30 калибра и с помощью трубки PE 10 проденьте иглу до основания.

Затем подайте силиконовую трубку на PE 10. Чтобы имплантировать катетер, прикрепите иглу катетера к пустому шприцу объемом в один миллилитр. Отрежьте квадратный кусок параформы в один дюйм и нанесите сверху каплю хирургической смазки.

После обезболивания мыши положите мышь на спину на бумажное полотенце и прикрепите носовой конус для подачи изофтора. Осторожно пальпируйте мочевой пузырь, чтобы вызвать мочеиспускание и избежать мочевого пузыря. Затем используйте салфетку со 100% этанолом для очистки периуретральной области.

Далее используйте 10% раствор повидон-йода и аппликатор с ватным наконечником для дезинфекции периуретральной области, промокните кончик иглы для инокуляции в хирургическую смазку. Затем введите катетер в отверстие уретры. После этого используйте пинцет, чтобы протолкнуть полиэтиленовую трубку к мочевому пузырю, в результате чего меньший силиконовый катетер будет помещен в мочевой пузырь.

Затем немедленно извлеките иглу с прикрепленной семимиллиметровой трубкой. После приготовления бактериального инокулюма НЖК используйте его для инокуляции мочевого пузыря и возвращения животного в клетку перед определением бактериальной нагрузки в соответствии со следующей демонстрацией. После того, как животное будет усыплено, положите его на спину и используйте 70% этанол для опрыскивания брюшной полости, препарируйте мышь, собрав мочевой пузырь, а затем почки в указанном порядке, и поместите органы в отдельные пятимиллилитровые пробирки, содержащие один XPBS.

Если мышь катетеризирована, извлеките катетер из мочевого пузыря и поместите его в отдельную трубку. После гомогенизации органов, подготовки серийного разведения и культивирования в течение ночи на LB-аэрах, подсчитайте колонии для подсчета IBC. После сбора мочевого пузыря поместите его в лунку с силиконовым покрытием из шести лунок с PBS и с помощью ножниц разрежьте его пополам.

С помощью небольших металлических штифтов, расположенных по внешним краям, аккуратно раздвиньте мочевой пузырь так, чтобы просвет был направлен вверх и было открыто максимальное количество уротелия. После выполнения окрашивания XI, как указано в текстовом протоколе, осмотрите КСГМГ, которые выглядят как синие точки под препарирующим микроскопом. Представленные здесь данные представляют собой колонизацию мочевыводящих путей в острой стадии прототипом изолята ИМП 89.

На этом рисунке показано, что КОЕ происходит через четыре недели после инокуляции мышей C3 HHEN от двух до семи КОЕ U ИМП I 89 В этих экспериментальных условиях от 20 до 50% инфицированных мышей развивают хронический цистит, в то время как у остальных 50-80% мышей устраняется инфекция. Количественное определение IBC является информативной мерой бактериальной нагрузки во время острого цистита, а высокие уровни IBC коррелируют с риском развития хронический цистит. Как видно здесь при окрашивании LAE бециазой, IBC выглядят как сине-фиолетовые точки на уротелии, которые можно посчитать на фоне C3 HHEN. В среднем на один мочевой пузырь можно увидеть около 50 IBC.

Данные, представленные здесь, получены из мышиной модели A UTI С ИМПЛАНТАТОМ мочевого пузыря и представляют собой 24-часовые инфекции со штаммом EPHA ONE ONE RF. Когда от 10 до семи КОЕ одного ОГ внутрипузырно вводится в непересаженный мочевой пузырь, инфекция начинает исчезать через 24 HPI и разрешаться с помощью 3D PI. И наоборот, OG one RF, инокулированный в имплантированный мочевой пузырь, приводит к колонизации как катетера, так и мочевого пузыря с десятикратно более высокими уровнями колонизации при 24 HPI, чем в неподсаженных мочевых пузырях. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как конфокальная и электронная микроскопия, для дальнейшей оценки образования IBC и локализации бактерий.

После своего развития этот метод затмил волну многих исследователей в области ИМП по изучению факторов вирулентности бактерий и реакций хозяина у мышей, которые резюмируют патогенез человека.