Флуоресценции зонда биомембрана Сила: Параллельное Количественное рецептор-лиганд кинетики и привязка вызванной внутриклеточной сигнализации на одну ячейку

Общая цель данной процедуры заключается в одновременном измерении связывания с рецептором и наблюдении за индуцированным связыванием кальциевым сигналингом в одной клетке. Это достигается путем предварительного выделения биотина и корректировки осмолярности эритроцитов человека (RBCs) для их использования в качестве сверхчувствительного преобразователя силы. Вторым этапом является функционализация стеклянных микросфер, которая включает очистку, расширение и покрытие лигандом.

Затем T-клетки изолируют и инкубируют с красителем на кальций Fluo-4, который позволяет наблюдать за концентрацией внутриклеточных ионов кальция. Заключительным этапом является подготовка микропипеток в экспериментальной камере, которые необходимы специально для данной установки эксперимента. В итоге используется метод флуоресцентного биомембранного силового зонда (BFP) для демонстрации адгезии клетки к покрытой лигандом микросфере, измерения кинетики связывания рецептора с лигандом и одновременного мониторинга уровня внутриклеточного кальция.

Данный метод полезен для понимания того, как механическая сила воспринимается T-клетками посредством распознавания андрогенов. Основным преимуществом этого метода перед существующими способами является то, что FBIP позволяет одновременно измерять кинетику связывания рецептора с лигандом и внутриклеточную передачу сигналов. Сложные этапы данного протокола включают ручное изготовление микро-пеп-путей правильного диаметра, захват клеток и бусин с помощью микро-ПЭП и сборку силового зонда, что на первых этапах может вызвать затруднения, хотя он и не смог присутствовать здесь для демонстрации в этом видео.

Соавтор Арнольд Г., который недавно защитил докторскую диссертацию в моей лаборатории, внес значительный вклад в первоначальную валидацию разработки протокола FBAP. Получите от 8 до 10 µL крови путем прокола пальца и добавьте ее к 1 mL карбонатно-бикарбонатного буфера; перемешайте смесь с помощью вортекса или пипетки и центрифугируйте в течение одной минуты при 900 ×g. Удалите супернатант перед повторным использованием карбонатно-бикарбонатного буфера. Промойте еще раз.

Затем смешайте 10 µL полученной суспензии эритроцитов, 171 µL карбонатно-бикарбонатного буфера и 1049 µL раствора линкера biotin-PEG-NHS и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Используя те же процедуры промывки, что и ранее, промойте полученную смесь эритроцитов один раз карбонатно-бикарбонатным буфером, а затем дважды 5% буфером N2.

Затем разведите нистатин в буфере N two 5%. Чтобы получить конечную концентрацию 40 µL/mL, смешайте 5 µL биотинизированных эритроцитов с 71,4 µL раствора нистатина и инкубируйте в течение одного часа при 0 °C. В завершение дважды промойте образцы буфером N two 5% и храните биотинизированные эритроциты в холодильнике в буфере N two 5% с добавлением 0,5% BSA; установите один трехдюймовый наконечник микропипетки в вытягиватель микропипеток.

Нажмите кнопку вытягивания (pull), чтобы аппарат нагрел середину капилляра и вытянул его с двух концов, создав два капилляра с острыми концами, которые и являются заготовками пипеток. Затем установите заготовку пипетки в держатель микропипетки. Нагрейте стеклянную сферу на горелке до расплавления. Введите кончик заготовки пипетки внутрь стеклянной сферы.

Охладите стеклянную сферу и вытяните сырую пипетку, чтобы она отломилась снаружи, оставив кончик внутри сферы. Повторяйте эту процедуру до получения отверстия нужного размера. Для создания камеры для клеток сначала разрежьте покровное стекло размером 40 мм на 22 мм на 0,2 мм с помощью стеклореза на два фрагмента размером 40 мм на 11 мм на 0,2 мм. Камера для клеток сооружается на основании самодельного держателя камеры, состоящего из двух металлических квадратов и соединяющей их ручки.

С помощью клея Grace приклейте одно покровное стекло к нижней стороне держателя кюветы так, чтобы оно перекрывало два металлических квадрата. Аналогичным образом приклейте второе покровное стекло к верхней стороне, чтобы сформировать параллельную кювету из двух покровных стекол. Затем с помощью пипетки введите 200 µL экспериментального буфера в пространство между двумя покровными стеклами.

Убедитесь, что буфер смачивает обе покровные стекла. Осторожно поверните и встряхните камеру, чтобы буфер коснулся обоих концов камеры. Затем аккуратно введите минеральное масло с обеих сторон камеры, по краям зоны с экспериментальным буфером, чтобы изолировать буфер от контакта с открытым воздухом.

Введите суспензии пробных бусин, которые являются белками связывания и мишенями, в верхнюю, среднюю и нижнюю области буферной зоны соответственно. Для начала эксперимента BFP включите микроскоп и источник света.

Поместите камеру на основной предметный столик микроскопа. Следующим шагом является установка всех трех микропипеток BFP. Зонд слева предназначен для захвата A RBC.

Мишень справа предназначена для захвата клетки, а вспомогательный элемент в нижней правой части служит для захвата устанавливаемой бусины; используйте микроинъектор, чтобы заполнить микропипетку экспериментальным буфером. Снимите микропипетку с держателя и удерживайте ее ниже, чтобы жидкость стекала с кончика. Быстро вставьте микропипетку в наконечник держателя, убедившись, что в микропипетку не попали пузырьки воздуха.

Во время установки затяните винт держателя, затем закрепите каждый держатель пипетки на соответствующем микроманипуляторе. Толкните микропипетку в сторону камеры так, чтобы их наконечники попали в область буфера камеры. Отрегулируйте положение микропипетки и найдите их в поле зрения микроскопа.

Перемещайте предметный столик с держателем камеры, чтобы найти колонии трех элементов. Поочередно регулируйте положение соответствующей микропипетки, поворачивая ручки манипуляторов, чтобы кончик микропипетки приблизился к одной клетке или бусине, после чего аспирируйте клетку или бусину. Регулируя давление внутри соответствующих микропипеток, зафиксируйте с помощью всех трех микропипеток соответствующие элементы.

Переместите столик с держателем камеры, чтобы найти свободное место вдали от колоний инъекционных элементов, где будет проводиться эксперимент. Переключите микроскоп в режим визуализации, чтобы изображение появилось в компьютерной программе. Переместите все три элемента на наконечниках пипеток в поле зрения программы.

Затем совместите зондовую бусину с эритроцитом и осторожно переместите бусину к вершине эритроцита. Теперь кратковременно прижмите бусину к эритроциту и плавно отведите назад; отрегулируйте давление вспомогательной микропипетки, чтобы аккуратно сдуть бусину, чтобы она осталась приклеенной к вершине эритроцита. Уберите вспомогательную пипетку и с помощью программы совместите цель и зондовую бусину.

В окне поля зрения используйте инструменты программы для измерения соответствующих радиусов микропипетки зонда, эритроцита (RBC) и круговой области контакта между эритроцитом и бусиной зонда. Эти значения позволяют оценить константу упругости эритроцита по формуле, приведенной в текстовом протоколе. После ввода желаемой константы упругости эритроцита в программе проведите горизонтальную линию через вершину эритроцита; это позволит получить в соседнем окне кривую, отображающую яркость каждого пикселя.

Переместите линию порога вдоль этой линии так, чтобы она находилась примерно на половине глубины кривой. Затем выберите нужный режим эксперимента: анализ тепловых флуктуаций, анализ частоты адгезии или анализ с зафиксированной силой. Установите параметры в соответствии с вашими требованиями.

Нажмите «Start», чтобы запустить программу, которая перемещает целевую пипетку и вводит цель в контакт с зондом и выводит ее из него; параллельно будет выполняться сбор данных, фиксирующих положение зонда с микросферой в режиме реального времени. Остановите программу, нажав кнопку «Stop experiment», после чего появится всплывающее окно. Для сохранения полученных данных с использованием функции флуоресценции системы BFP включите источник возбуждающего света и флуоресцентную камеру, управление которыми осуществляется через отдельную программу.

Затем выберите параметры флуоресцентной визуализации, включая усиление, время экспозиции и каналы возбуждения. Выполните все подготовительные этапы согласно протоколу эксперимента с BFP, включая юстировку зонда и мишени для визуализации живого флуоресцентного изображения целевой клетки, возбуждаемого светом с длиной волны 340 нм или 380 нм. Используйте инструмент секционирования, чтобы примерно ограничить область, в которой клетка будет находиться в течение всего периода записи.

Затем одновременно нажмите кнопку записи (record) и начните кликать. Запись позволяет свету с длиной волны 340 нанометров и 380 нанометров поочередно возбуждать внутриклеточный флуоресцентный краситель. Пара соответствующих флуоресцентных изображений будет записываться попеременно примерно раз в секунду.

Нажатие кнопки start запускает эксперимент BFP для анализа молекулярных взаимодействий и эксперимент по флуоресцентной визуализации для мониторинга внутриклеточной передачи сигналов кальция; затем перейдите к анализу данных согласно текстовому протоколу. На кривых необработанных данных зависимости силы от времени сила рассчитывается на основе отслеживания изменения положения зонда. При отсутствии события адгезии значение силы вернется к нулю на сигнале обратного действия силы после того, как целевая клетка будет отведена от поверхности зонда.

Напротив, при событии разрыва связи адгезия проявляется в виде быстрого повышения силы до положительного уровня во время ретракции с последующим резким падением обратно до нуля. При событии определения времени жизни положительная сила будет поддерживаться на постоянном уровне, образуя плато. Длина этого плато соответствует времени жизни.

Путем многократного проведения циклов эксперимента VFP будет получена кривая зависимости силы от времени. Здесь представлены флуоресцентные изображения нескольких или двух нагруженных Т-клеток при возбуждении световыми каналами с длиной волны 340 нм и 380 нм. На обоих изображениях видны четкие контуры клетки, что свидетельствует о качественном окрашивании. После получения данных о кинетике связывания и данных флуоресценции для Т-клетки, на одном рисунке представлены как кривая совокупного времени жизни, так и кривая уровня кальция для выявления корреляции между ними.

Теперь вы должны иметь четкое представление о том, как проводить эксперимент A-F-B-I-P. В ходе данной процедуры важно не забывать проверять датчик силы на наличие дефектов, таких как диаметр микропипетки, длина выступа резиновой ячейки и положение микросферы.

Все это повлияет на точность измерения силы. Данный метод открывает возможности для исследователей в области молекулярной механической биологии по изучению механизмов механической трансдукции во всех возможных биологических системах.