Флуоресценции зонда биомембрана Сила: Параллельное Количественное рецептор-лиганд кинетики и привязка вызванной внутриклеточной сигнализации на одну ячейку

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы одновременно измерить рецептороподобность и связывание, а также наблюдать за индуцированной связыванием кальциевой сигнализацией на одной клетке. Это достигается путем выделения биотина и регулировки осмолярности эритроцитов человека или эритроцитов, чтобы использовать их в качестве сверхчувствительного преобразователя силы. Вторым шагом является функционализация микромасштабных стеклянных шариков, которая включает в себя очистку, расширение и лигандное покрытие.

Затем Т-клетки изолируют и инкубируют с кальциевым красителем менее 2:00 AM, что позволяет наблюдать за внутриклеточной концентрацией ионов кальция. Заключительным этапом является подготовка микропипеток в экспериментальной камере, которые особенно необходимы для проведения эксперимента. В конечном счете, флуоресцентный биомембранный силовой зонд или метод BFP используется для демонстрации адгезии клетки к покрытому лигандом шарику, измерения кинетики связывания лиганда рецептора и одновременного мониторинга внутриклеточного уровня кальция.

Этот метод полезен для понимания того, как механическая сила воспринимается Т-клетками посредством распознавания андрогенов. Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими методами является то, что FBIP может одновременно измерять кинетику связывания рецепторного лиганда и внутриклеточную сигнализацию. Сложные части этого протокола включают в себя ручное создание микротропинок правильного диаметра, захват ячеек и пчел с помощью микроПЭП и сборку силового зонда, который поначалу может выйти из строя, хотя он не смог присутствовать здесь для демонстрации этого видео.

Соавтор Арнольд Г., который недавно защитил докторскую диссертацию в моей лаборатории, внес значительный вклад в первоначальную валидацию изготовления протокола FBAP. Получите от восьми до 10 микролитров крови из пальца и добавьте к одному миллилитру карбонатного бикарбоната, буферной струей оставьте вихревую или пипетку смеси и центрифугируйте в течение одной минуты при 900 G. Выбросьте надосадочную жидкость перед выполнением карбонатного бикарбонатного буфера. Умойте еще раз.

Далее смешайте 10 микролитров полученного эритроцита, упакуйте 171 микролитр карбонатного бикарбонатного буфера, и 1049 микролитров биотина. Раствор линкера PEG NHS и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. С помощью тех же процедур промывки перед промыванием полученной смеси эритроцитов один раз с карбонатным гидрокарбонатным буфером, а затем дважды с N двумя 5%-ными буферами.

Далее разведите Нистатин в N два 5% буфера. Чтобы получить концентрацию 40 микролитров на миллилитр, смешайте пять микролитров биотинилированного эритроцита с 71,4 микролитрами раствора нистатина и инкубируйте в течение одного часа при нуле градусов Цельсия. Наконец, дважды промойте образцы N two 5% буфером и храните биотинилированный эритроцит с N two 5% буфером плюс 0,5% BSA в холодильнике

Нажмите кнопку вытягивания, чтобы середина капилляра нагревалась аппаратом, а капилляр тянулся с двух концов, чтобы образовались два капилляра с острыми кончиками, которые являются необработанными пипетками. Затем установите необработанную пипетку на держатель пипетки микропипетки Forge Heat, чтобы расплавить стеклянную сферу на кузнице. Вставьте кончик необработанной пипетки внутрь стеклянной сферы.

Охладите стеклянную сферу и потяните за сырую пипетку, чтобы разбить ее снаружи, оставив ее кончик внутри сферы. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока не будет получено нужное отверстие для наконечника, чтобы соорудить камеру ячейки, сначала разрезанную до 40 миллиметров на 22 миллиметра на 0,2 миллиметра с помощью стеклорезака на две части размером 40 миллиметров на 11 миллиметров на 0,2 миллиметра. Клеточная камера построена на фундаменте самодельного держателя камеры, состоящего из двух металлических квадратов и ручки, которая связывает их между собой.

С помощью изящного клея прикрепите одну крышку к нижней стороне держателя камеры таким образом, чтобы она соединила два металлических квадрата. Аналогично приклейте другую крышку ячейки с верхней стороны, которая образует параллельную камеру защитного стекла. Затем с помощью пипетки введите 200 микролитров экспериментального буфера между двумя покровными стеклами.

Убедитесь, что буфер прикреплен к обоим защитным стеклам. Осторожно поверните и встряхните камеру, чтобы буфер коснулся обоих концов камеры. Затем осторожно впрыскивают минеральное масло с обеих сторон камеры, обойдя экспериментальную буферную зону, тем самым изолируя буфер от открытого воздуха.

Вводимые суспензии prob. Бусины являются bcs и мишенями в верхней, средней и нижней областях буферной зоны соответственно. Чтобы начать эксперимент BFP, включите микроскоп и источник света.

Поместите камеру на главный предметный столик микроскопа. Следующим этапом является установка всех трех микропипеток BFP. Щуп слева — захватить РБК.

Цель справа - захватить ячейку, а помощник справа внизу служит для захвата шарика для установки, с помощью микроинжектора заполнить микропипетку экспериментальным буфером. Снимите микропипетку с держателя пипетки и держите ее в более низком месте, чтобы жидкость могла капать с наконечника. Быстро вставьте микропипетку в наконечник держателя, следя за тем, чтобы в микропипетку не попали пузырьки воздуха.

Во время установки затяните винт держателя, затем установите каждый держатель для пипетки на соответствующий микроманипулятор. Надавите на микропипетку по направлению к камере так, чтобы их кончики вошли в буферную зону камеры. Отрегулируйте положение микропипеток и найдите их под полем зрения микроскопа.

Перемещайтесь по ступень держателя камеры, чтобы найти колонии трех стихий. Одну за другой регулируйте положение соответствующей микропипетки, поворачивая ручки манипуляторов так, чтобы кончик микропипетки приближался к одной клетке или шарику, отсасывал ячейку или шарик. Регулируя давление внутри соответствующей микропипетки, все три микропипетки захватывают соответствующие элементы.

Перемещайтесь вокруг ступеней держателя камеры, чтобы найти открытое пространство вдали от колоний вводимых элементов, где будет проводиться эксперимент. Переключите визуальный режим микроскопа для визуализации изображения в компьютерной программе. Переместите все три элемента на наконечниках пипеток в поле зрения программы.

Далее совместите валик щупа и эритроциты и осторожно переместите бусину щупа к вершине эритроцитов. Теперь кратковременно ударьте бусину о эритроцит и аккуратно втяните, отрегулируйте давление вспомогательной микропипетки, чтобы аккуратно сдуть бусину так, чтобы она осталась приклеенной к верхушке эритроцита. Отодвиньте вспомогательную пипетку в сторону и совместите мишень и щуп на программе.

В окне поля зрения с помощью программных инструментов измерьте соответствующие радиусы микропипетки зонда, эритроцитов и круговой зоны контакта между эритроцитами и шариком зонда. Эти значения позволяют оценить постоянную пружины эритроцитов по уравнению, приведенному в текстовом протоколе. После ввода в программу желаемой пружинной константы эритроцитов проведите горизонтальную линию поперек вершины эритроцита, в результате чего в соседнем окне получится кривая, указывающая яркость каждого пикселя.

Вдоль этой линии перетащите пороговую линию примерно на половину глубины кривой. Далее выберите нужный режим эксперимента, анализ частоты адгезии тепловых флуктуаций или силовой зажимной анализ. Задайте нужные параметры.

Нажмите кнопку «Пуск», которая позволит программе перемещать целевую пипетку и направлять мишень в контакт с зондом, сбор данных будет выполняться параллельно, что записывает положение про шарика в режиме реального времени. Остановите программу, нажав на кнопку остановки эксперимента, в которое через некоторое время выскочит окно. Для сохранения полученных данных можно воспользоваться функцией флуоресценции системы BFP, включенным возбуждающим источником света и флуоресцентной камерой, которые управляются отдельной программой.

Затем выберите параметры для флуоресцентной визуализации, включая усиление экспозиции и каналы возбуждения. Следуйте всем инструкциям в протоколе эксперимента BFP, включая выравнивание зонда и мишени, чтобы обеспечить визуализацию живого флуоресцентного изображения клетки-мишени, которое возбуждается возбуждающим светом с частотой 340 или 380 нанометров. Используйте инструмент секционирования, чтобы примерно разделить область, в пределах которой ячейка будет находиться в течение всего периода записи.

Далее одновременно нажимаем на запись и начинаем кликать. Record позволяет свету 340 нм и 380 нм попеременно возбуждать внутриклеточный флуоресцентный кристалл. Пара соответствующих флуоресцентных изображений будет поочередно записываться примерно по одному в секунду.

Нажатием на кнопку «Старт» начинается эксперимент BFP по анализу молекулярного взаимодействия и эксперимент с флуоресцентной визуализацией для мониторинга внутриклеточной передачи кальциевой сигнализации, переход к анализу данных, как описано в текстовом протоколе. В кривых необработанных данных временной силы сила получается из отслеживания изменения положения профессионального валика. В случае отсутствия адгезии сила вернется к нулю в сигнале обратного времени после того, как целевая ячейка будет отведена от поверхности валика.

И наоборот, при событии силы разрыва сцепление будет проявляться в быстром повышении силы до положительного уровня во время втягивания, за которым следует быстрое падение до нуля. В жизненном событии положительная сила будет зажата для достижения плато. Протяженность плато – это целая жизнь.

Путем повторного проведения экспериментальных циклов VFP будет получена кривая зависимости силы от времени. Здесь представлены флуоресцентные изображения нескольких или двух заряженных Т-элементов при возбуждении световыми каналами 340 и 380 нм. На обоих изображениях видны четкие контуры клетки, указывающие на то, что клетка была хорошо окрашена После того, как данные кинетики связывания и данные флуоресценции были получены от Т-клетки, как кумулятивная кривая времени жизни, так и кривая уровня кальция представлены на одном и том же рисунке, чтобы найти корреляцию между ними.

Теперь у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить эксперимент A-F-B-I-P. Во время этой процедуры. Важно не забыть проверить, есть ли какие-либо дефекты силового щупа, такие как диаметр микропипетки, длина выступа резиновой ячейки и положение шарика.

Все это повлияет на точность измерения силы. Этот метод открывает путь исследователям в области молекулярной механической биологии к изучению механизма механической трансдукции во всех возможных биологических системах.