Пользовательские разработанный на основе лазера Отопление Аппарат для Triggered версии цисплатина из термочувствительного липосом с магнитно-резонансной Руководство Image

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать работу специально сконструированного аппарата для лазерного нагрева, который может быть использован для локального нагрева подкожных опухолей с целью доставки термоактивируемой липосомальной формуляции. Это достигается путем предварительного приготовления формуляции HTLC посредством формирования липидной пленки, экструзии при гидратации и диализа. На втором этапе подопытной мыши вводят клетки карциномы шейки матки.

Через четыре-пять недель опухоль иссекают, разрезают на фрагменты и имплантируют по отдельности в мышь-реципиент. На заключительном этапе опухоль мыши-реципиента подвергают локальному нагреву до 42 °C с помощью системы лазерного нагрева. Аппарат лазерного нагрева совместим с МРТ, что позволяет контролировать изменения температуры ткани во время подачи света, а также является компактным и портативным, что обеспечивает простой и эффективный нагрев опухоли внутри гентри МРТ для мелких животных.

В конечном итоге, теплоактивируемое высвобождение из термочувствительного HTLC может контролироваться с помощью магнитно-резонансной томографии в режиме реального времени. Основным преимуществом данного метода перед существующими, такими как использование водяной бани и нагревательного катетера, является то, что наш метод обеспечивает конформную подачу тепла к опухоли в течение одной-двух минут после начала тепловой терапии и позволяет регулировать мощность лазера в режиме реального времени, сводя к минимуму температурные колебания во время процедуры. Идея этого метода возникла у нас, когда мы начали проводить исследования in vivo с нашей формуляцией термочувствительных липосом HTLC.

Мы обнаружили, что существующие методы не позволяют эффективно осуществлять локальный нагрев подкожной опухоли. Процедуры приготовления липосом продемонстрирует Мён, аспирант из моей лаборатории. Для приготовления липосом начните с объединения свежеприготовленной липидной смеси со свежеприготовленной смесью липидов и лекарственного препарата, после чего проведите гидратацию в течение одного часа с перемешиванием на вортексе каждые 15–20 минут в процессе гидратации липидной смеси. Соберите 10 мл экструдера с двумя стопками поликарбонатных фильтров 200 nm, поместите термоблока экструдера в циркуляционную водяную баню, установленную на 70 °C, и подключите устройство к баллону со сжатым азотом.

Сразу после гидратации перенесите липиды в камеру экструдера и откройте поток азота. Затем при давлении 200 PSI пропустите липосомы через мембраны, собирая их в коническую пробирку объемом 50 миллилитров, помещенную в водяную баню при 70 °C. После пятикратной экструзии липосом разберите устройство и соберите его заново, установив два стека поликарбонатных фильтров с размером пор 100 нм.

Установите давление 400 PSI и пропустите липосомы через экструдер 10 раз, как было только что продемонстрировано. Соберите липосомы после финальной экструзии в коническую пробирку объемом 15 мл и дайте им остыть до комнатной температуры, после чего осадите нерастворимый цисплатин путем центрифугирования; затем в стерильных условиях диализируйте липосомы в течение ночи против 0,9% физиологического раствора, используя диализную трубку с пределом отсечения по молекулярной массе 15 000 Да. Для имплантации ксенограф опухоли шейки матки возьмите 180 клеток из культуры с 90% конфлюэнтностью и подсчитайте количество жизнеспособных клеток карциномы шейки матки с помощью гемоцитометра.

Затем с помощью цитометра разведите клетки до концентрации 1 × 10⁶ клеток на 100 µL. Все работы с животными проводились в Star Innovation Center; самкам мышей линии SCID вводили клетки путем внутримышечной инъекции в икроножную мышцу задней конечности. С помощью штангенциркуля измеряли размер образовавшейся опухоли до тех пор, пока ее максимальный размер не достигал 9–12 мм. После этого опухоль извлекали из мыши-донора и измельчали на фрагменты размером 2–3 мм³.

Теперь выбрейте шерсть на левой задней конечности животного-реципиента и сделайте надрез на обнаженной коже. Введите один фрагмент донорской опухоли подкожно через надрез и через три-пять дней после имплантации закройте кожу с помощью одного-двух хирургических скоб. Удалите скобы и дайте опухоли расти в течение двух-трех недель перед проведением термической обработки.

Сначала подсоедините один конец лазерного волокна к лазерному устройству, а другой — к облучателю. Затем введите инъекционный катетер 27G в латеральную хвостовую вену мыши-реципиента, находящейся под наркозом, после чего введите катетер 22G в центр опухоли. Затем поместите волоконно-оптический температурный датчик в полый катетер для мониторинга любых изменений температуры и накройте всю опухоль облучателем. Конец.

Установите мощность в диапазоне от 0,8 до 1 Вт, затем включите лазер и дождитесь повышения температуры, вручную регулируя мощность лазера в течение всего процесса обработки от 0,1 до 0,8 Вт для поддержания температуры опухоли на уровне 42 °C, как показано на этом изображении поперечного сечения термически обработанной опухоли. При общей мощности 1 Вт максимальная плотность потока энергии в любой точке опухоли составляет 70 мВт/см², при этом плотность потока в опухоли на глубине кожи составляет 50% от максимальной, что подтверждается данными магнитно-резонансной термометрии по сдвигу протонной резонансной частоты при нагреве. Использование установки для лазерного нагрева позволяет получить относительно равномерную карту распределения температуры, показанную на изображении, которая отслеживает относительное изменение температуры по сравнению с абсолютным базовым измерением, полученным перед нагревом точечным источником. Нагретая опухоль демонстрирует наибольшее относительное увеличение сигнала по сравнению с ненагретой мышцей в области опухоли после введения gad HTLC, что определено путем анализа сигнала магнитного резонанса, при этом сигнал сохраняется до конца периода нагрева. После освоения эта методика может быть развернута менее чем за 15 минут при правильном выполнении, что делает ее ценным инструментом для доклинической оценки составов термочувствительных липосом.

Не забывайте, что работа с лазером четвертого класса может быть крайне опасной, и при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование защитных очков.