Органотипической Высокая пропускная система для характеризации наркотиками чувствительности первичных клетки множественной миеломы

Общая цель данной процедуры заключается в количественной оценке химиочувствительности первичных клеток множественной миеломы к панели химиотерапевтических препаратов. Это достигается путем первоначального смешивания клеток множественной миеломы, выделенных из свежего аспирата костного мозга, с предварительно культивированной стромой, полученной от пациента, и коллагеном. На втором этапе смесь CEL высевают в многолуночный планшет.

Затем клетки обрабатывают интересующими химиотерапевтическими препаратами, и планшет переносят в инкубатор микроскопа с моторизованным столиком для последовательной визуализации клеток в течение 96-часового периода инкубации. В конечном итоге для построения кривых выживаемости для каждого препарата и концентрации может быть использован алгоритм цифрового анализа изображений. Основными преимуществами данного метода по сравнению с существующими методами оценки жизнеспособности по конечной точке являются возможность тестирования нескольких химиотерапевтических препаратов на одном образце пациента, а также возможность лонгитюдного измерения жизнеспособности клеток пациента в течение нескольких дней без необходимости отделять клетки от стромы или матрикса.

Значение данного метода распространяется на терапию гемопоэтических опухолей, так как теоретически он может быть использован для прогнозирования клинического ответа на конкретные схемы химиотерапии. Идея данного протокола возникла у нас, когда мы поняли, что замена исходных микрофлюидных предметных стекол на многолуночные планшеты позволит значительно сократить стоимость и время, необходимые для проведения эксперимента. Для подготовки первичных кокультур клеток множественной миеломы и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга с помощью многоканального дозатора начните с суспендирования клеток в RPMI 1640 в шестикратной конечной концентрации.

Затем смешайте по 50 microliters каждого типа клеток со свежеприготовленным коллагеном первого типа до конечного объема 300 microliters. После этого с помощью многоканального дозатора вручную внесите по восемь microliters смеси клеток с матриксом в центр каждой лунки планшета на 384 лунки и центрифугируйте планшет, чтобы сконцентрировать все клетки в одной фокальной плоскости.

После центрифугирования инкубируйте планшеты в условиях культивирования клеток в течение одного часа для полимеризации геля. Затем добавьте по 80 µL дополненной ростовой среды в каждую лунку и инкубируйте планшет в течение ночи, чтобы строма прикрепилась к дну планшета. Для подготовки кокультур стромы при множественной миеломе с использованием роботизированного дозатора начните с суспендирования 300 µL CD138-положительных клеток множественной миеломы и 300 µL стромальных клеток в среде RPMI 1640 с плотностью в шесть раз выше желаемой конечной, как было только что продемонстрировано.

Затем смешайте оба типа клеток в пробирке объемом 1,5 мл с маркировкой CD 1 38 positive и поместите пробирку в инкубатор для культур клеток. Далее суспендируйте 60 µL соответствующей клеточной линии множественной миеломы и 60 µL стромальных клеток в среде RPMI 1640 с плотностью в шесть раз выше конечной желаемой, смешайте оба типа клеток в пробирке объемом 1,5 мл с маркировкой «cell line» и также инкубируйте при 37 °C. Загрузите файл скрипта посева клеток в роботизированный дозатор.

Затем поместите коробку с наконечниками для 200 мкл пипеток в станцию A, микротитрационный планшет в станцию B и стерильный 384-луночный планшет в станцию E робота. Далее смешайте смесь положительных по CD138 клеток с пробиркой свежеприготовленной предварительно смешанной среды CD138 и перенесите 1,5 мл полученного клеточного раствора в лунку номер один микротитрационного планшета.

Поместите остальные клетки на лед и запустите программу. Робот заполнит первые 176 лунок планшета на 384 лунки, после чего произойдет пауза. В это время перенесите оставшиеся CD 1 38 положительные клетки во вторую лунку микротитрационного планшета и возобновите выполнение программы.

Робот обнаружит оставшиеся 144 лунки планшета и снова приостановит работу. Теперь смешайте клетки из пробирки с клеточной линией с пробиркой свежеприготовленной смеси для клеточной линии и перенесите содержимое в лунку номер три микротитрационного планшета. Затем снова запустите программу, чтобы робот мог засеять оставшиеся 64 лунки в 3 84-луночных планшетах.

После посева клеток в последнюю лунку центрифугируйте их и перенесите ко-культуры в инкубатор для культур клеток для полимеризации коллагена. Через один час загрузите в робот скрипт для нанесения слоя среды, поместите коробку с наконечниками для пипетки объемом 120 microliter в станцию A, резервуар с 31 milliliters среды RPMI 1640 с добавлением фетальной бычьей сыворотки, плазмы пациента и антибиотиков в станцию B, а 84-луночный планшет CED 3 — в станцию E. Затем запустите программу. Робот перенесет по 81 microliters дополненной среды в каждую лунку.

После завершения работы робота верните клетки в инкубатор, чтобы строма за ночь прикрепилась к субстрату. Чтобы обработать высеянные клетки интересующим препаратом, сначала загрузите в пользовательском интерфейсе роботизированного дозатора скрипт для планшета с лекарственным средством в среде. Затем поместите бокс с наконечниками для пипеток объемом 120 µL в станцию A, резервуар с 21 mL RPMI 1640, дополненного плазмой пациента FPS и антибиотиками, в станцию B и пустой 384-луночный планшет в станцию E; запустите программу, и роботизированный дозатор добавит по 30 µL среды во все лунки.

Используйте 3 84-луночных планшета. Затем, следуя шаблону, добавьте в каждую лунку микротитрационного планшета по 200 µL препарата в концентрации, в 20 раз превышающей максимальную. В контрольные лунки добавьте среду, дополненную FBS, плазмой пациента и антибиотиками.

Затем поместите коробку с наконечниками для дозатора объемом 120 мкл в станцию A, микротитрационный планшет с препаратами в станцию B и 3 84-луночный планшет со средой в станцию C, после чего загрузите программу добавления препаратов. Роботизированный дозатор выполнит серийное разведение от 1 до 3, как показано на данном рисунке. Теперь поместите новую коробку с наконечниками для дозатора объемом 120 мкл в станцию A, 3 84-луночный планшет с разведенным препаратом в станцию B и 3 84-луночный планшет с высеянными клетками в станцию C, затем запустите программу добавления препаратов.

Роботизированный дозатор перенесет 8 µL препарата из каждой лунки планшета с препаратами в соответствующую лунку планшета с клетками. После обработки последней лунки немедленно переместите планшет с клетками в инкубатор цифрового микроскопа. Затем для получения изображений клеток протрите внутреннюю поверхность настольного инкубатора влажной салфеткой с этанолом и осторожно замените крышку планшета крышкой инкубатора.

Затем выполните инструкции программного обеспечения по добавлению ориентиров для областей интереса, которые будут последовательно визуализироваться в ходе эксперимента. Наконец, используя объектив с пяти- или десятикратным увеличением, настройте фокус до тех пор, пока клетки множественной миеломы не будут выглядеть как яркие диски, окруженные темным кольцом, а стромальные клетки станут едва заметными. В данном эксперименте живые клетки множественной миеломы были окрашены в зеленый цвет (псевдораскраска); к концу эксперимента при максимальной концентрации препарата, когда все клетки множественной миеломы погибли, зеленый сигнал в стромальных клетках и эндотелиальных клетках пупочной вены человека практически не наблюдался или отсутствовал.

Затем с помощью программного обеспечения робота была зафиксирована постепенная потеря жизнеспособности, вызванная воздействием различных концентраций препарата с течением времени. Перед началом процесса визуализации важно тщательно осмотреть все засеянные лунки, так как артефакты могут привести к ошибкам в работе программного обеспечения для анализа изображений и к получению ложных результатов. Например, здесь показан результат избыточной плотности стромальных клеток или слишком длительного интервала между трипсинизацией и посевом, что привело к образованию клеточных агрегатов, как видно на данном изображении.

Если клеточные линии высевают при слишком высокой плотности, в процессе репликации они будут образовывать колонии, что снизит точность алгоритма цифрового анализа изображений, так как станет все труднее отличить одну клетку от другой; в данном случае было высевано слишком мало клеток множественной миеломы. Если количество клеток множественной миеломы, полученных из аспирата костного мозга, составляет менее 500,000, необходимо перед высевом клеток определить мертвый объем используемой пробирки и учесть этот объем в расчетах разведения. После освоения данную методику можно выполнить за два-три часа.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости хранить предварительно смешанную среду с коллагеном на льду, чтобы предотвратить полимеризацию до того, как клетки будут готовы. Это также помогло изучить, как гетерогенность химиочувствительности опухолевой массы может определять глубину и продолжительность ответа пациента.