3D-человека легочной ткани Модель функциональных исследований по

Общая цель данной процедуры заключается в создании модели легочной ткани in vitro для изучения инфекции M tuberculosis. Для этого сначала на фильтр вставки планшета для культивирования клеток наносится слой коллагенового матрикса фибробластов. На втором этапе на слой коллагена фибробластов высевают инфицированные иммунные клетки и клетки эпителия легких.

Полученную 3D-модель ткани затем подвергают воздействию воздуха для стимуляции секреции слизи и стратификации эпителия. На заключительном этапе ткань собирают и фиксируют на предметном стекле. В конечном итоге используют иммунофлуоресцентную микроскопию для анализа формирования ранней гранулемы, индуцированной M tuberculosis.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как культура клеток в один слой in vitro, является то, что в этой системе клетки находятся в трехмерном микроокружении, что позволяет формировать гранулемы при заражении вирулентными микобактериями, напоминающие очаги туберкулеза у человека. Для подготовки фибробластов, встроенных в коллаген, начните с обработки клеток легочных фибробластов трипсином в течение 10 минут при 37 °C. После открепления клеток остановите реакцию, добавив 8 мл полной среды DMEM, затем центрифугируйте клетки. Ресуспендируйте осадок в свежей среде DMEM до концентрации 230 000 клеток/мл и поместите клетки на лед. Затем установите по одному вкладышу в каждую лунку шестилуночного планшета.

В лунки планшета внесите по 1 мл свежеприготовленной смеси для создания клеточного слоя в каждый вкладыш, следя за тем, чтобы смесь полностью покрывала вкладыш и в ней не было пузырьков воздуха. Затем поместите планшет в инкубатор при 37 °C на 30 минут. По окончании инкубации в стерильной конической пробирке на льду смешайте 2 мл коллагена с 615 µL премикса, чтобы нейтрализовать pH коллагена для каждого вкладыша.

Затем добавьте в коллагеновую смесь 58 µL среды DMEM и 327 µL суспензии фибробластов легкого на каждый вкладыш. Перемешайте содержимое путем многократного пипетирования для равномерного распределения клеток по всей смеси. Затем быстро добавьте по 3 мл клеточного слоя по стенке каждого вкладыша на каждый бесклеточный слой коллагена.

Осторожно, избегая образования пузырьков воздуха, поместите планшет обратно в инкубатор для культур клеток еще на два часа. После полимеризации коллагена добавьте по 2 мл полноценной среды DMEM в дно каждой лунки и верните планшет в инкубатор еще на 24 часа. На следующий день с помощью чистого пинцета осторожно приподнимите вставки по одной и аспирируйте культуральную среду из дна каждой лунки.

Затем добавьте по 2 mL полноценной среды DMM на дно каждой лунки и по 2 mL полноценной среды DMM в каждый вкладыш. Заменяйте оба объема среды каждые два дня в течение пяти–семи дней. Для подготовки инфицированных макрофагов сначала инкубируйте культуру макрофагов в течение четырех часов с вирулентными M tuberculosis при множественности заражения 10.

По окончании инкубации трижды промойте клетки раствором PBS для удаления внеклеточных бактерий, затем обработайте макрофаги 2 мM DTA в течение 10 минут при 37 °C. После открепления клеток ресуспендируйте их в полной среде DMM без антибиотиков. Затем аспирируйте всю среду из планшета с коллагеновым матриксом фибробластов и добавьте 1,5 мл свежей полной среды DMM без антибиотиков во внешние камеры.

Затем смешайте флуоресцентно меченные моноциты с инфицированными макрофагами в соотношении пять к одному в 50 µL без антибиотиков полноцельной среды DMEM на один инсерт. Затем добавьте 50 µL смеси моноцитов и макрофагов внутрь каждого инсерта и верните планшет в инкубатор. Через один час медленно добавьте два миллилитра культуральной среды по стенкам инсертов, чтобы избежать смещения клеток, и инкубируйте культуры еще 24 часа.

Для посева культур эпителиальных клеток легкого добавьте 4 миллиона эпителиальных клеток на миллилитр в 50 мкл полной среды dmm поверх коллагеновых матриц с иммунными клетками и фибробластами. Инкубируйте клетки в течение двух минут при комнатной температуре, затем в течение одного часа при 37 °C. После этого осторожно добавьте в инсерты два миллилитра полной среды DMM без антибиотиков, как было продемонстрировано, и культивируйте клетки еще в течение трех дней.

Через пять дней после посева инфицированных макрофагов аспирируйте всю культуральную среду из планшета и добавьте 1,8 milliliters полноценной среды DMM без антибиотиков во внешние камеры. Затем подвергните 3D-модели тканей воздействию воздуха в инкубаторе в течение двух дней, не добавляя среду в инсерт на седьмой день после посева.

Полностью удалите среду из планшета и инкубируйте тканевые модели в 4% паральдегиде в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Затем с помощью скальпеля отделите мембраны от вставок лунок. После этого, используя чистый скальпель, осторожно удалите края тканевых моделей и разрежьте каждую ткань на четыре примерно равных по размеру квадратных фрагмента.

Перенесите фрагменты на суперморозостойкие предметные стекла и дайте им высохнуть в течение пяти минут. Затем, используя флуоресцентную среду для заключения, содержащую антифейд и DPI, зафиксируйте ткани и накройте их покровными стеклами. Оставьте стекла при комнатной температуре в темноте до полного высыхания, после чего загерметизируйте края покровного стекла лаком для ногтей.

После высыхания лака погрузите предметные стекла в 70% ethanol для выноса образцов из помещения уровня BSL-3. Для визуализации тканей с помощью флуоресцентного конфокального микроскопа получите 3D-изображения от пяти до 10 различных полей, охватывающих весь фрагмент ткани, с разрешением 512x512 пикселей, при этом Z-стек должен охватывать толщину не менее 20 micron с шагом между срезами от 1 до 1.5 micron для последующей 3D-квантификации клеточных кластеров. Откройте программное обеспечение для обработки 3D-изображений и загрузите интересующий вас снимок.

Затем с помощью инструмента настройки отображения отрегулируйте каждый канал по изображению, контрастности, яркости и непрозрачности смешивания, чтобы оптимизировать объемный рендеринг и минимизировать шумовые помехи. Далее, для визуализации поверхности ткани выберите красный канал моноцитов и с помощью фильтров установите соответствующие пороги, чтобы ограничить выборку красных моноцитов или исключить фоновый сигнал по мере необходимости. В завершение экспортируйте данные в подходящую программу для работы с электронными таблицами для последующего анализа.

На седьмой день после посева клеток, инфицированных M tuberculosis, конфокальная микроскопия выявляет скопление красных моноцитов в месте инфекции, о чем свидетельствует присутствие зеленых бактерий, имитирующих поражения при туберкулезе человека, известные как гранулемы 3D. Визуализация обеспечивает возможность взаимодействия, изучения и количественной оценки нескольких параметров. Например, на данных изображениях 3D-изображение демонстрирует скопление моноцитов в месте локализации M tuberculosis.

Пространственное расположение зеленых бактерий и красных кластеров моноцитов можно наблюдать при апикальном, ротационном и латеральном обзорах. Как и ожидалось, в неинфицированных тканях такие кластеры не наблюдались. Количественная оценка размера и количества моноцитов, клеточных кластеров и тканей, инфицированных M tuberculosis, показала, что размер клеточных кластеров увеличивается, тогда как количество отдельных моноцитов снижается по сравнению с моделями неинфицированных тканей.

Потенциальные области применения данной модели легочной ткани включают изучение роли различных иммунных клеток и тканевого иммунитета при туберкулезе, исследование фенотипов микобактерий, а также тестирование перспективных лекарственных препаратов, уничтожающих микобактерии внутри гранулемы.