Воспроизводимым Компьютерный метод количественного капиллярного плотности с использованием Nailfold Капилляроскопия
27 октября 2015 г.
Капилляроскопия - это неинвазивная, эффективная, относительно недорогая и простая в освоении методология для непосредственной визуализации капилляров в микроциркуляции. Тем не менее, только одна публикация на сегодняшний день описывает надежность сложного программного обеспечения, доступного для количественного определения данных капилляроскопии. Здесь мы представляем простой и надежный протокол для количественного определения капилляров с помощью стандартизированного алгоритма.
Общая цель данной процедуры — количественное определение числа капилляров на квадратный миллиметр в области кожи непосредственно под кутикулой ногтя. Для этого сначала делают монохромный снимок ногтевого ложа под кутикулой. На втором этапе изображение импортируют в компьютерную программу для анализа изображений.
Затем выполняется обработка изображений. Для лучшей визуализации капилляров на заключительном этапе необходимо идентифицировать и подсчитать все капилляры в пределах одного квадратного миллиметра. В конечном итоге манипуляции с изображениями используются для демонстрации количества и морфологии капилляров отдельного индивидуума. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сердечно-сосудистых заболеваний, например, о том, как гипертония, диабет и другие патологии могут влиять на микроциркуляцию.
Используя монохромную цифровую камеру, получите изображения капилляров, как было описано ранее. Затем сделайте калибровочные снимки линейки с миллиметровыми делениями, используя ту же камеру и условия увеличения, которые применялись для получения изображений капилляров. Импортируйте изображение линейки в программу для анализа изображений и измерьте количество пикселей в отрезке длиной один миллиметр на фотографии линейки.
Запишите это число и вычислите количество пикселей в области размером один миллиметр на один миллиметр. Затем откройте одно из изображений капилляров, затемните капилляры и осветлите фон, отрегулировав изображение с помощью гистограммы с наилучшим соответствием. После этого используйте команду create ROI в выпадающем меню, чтобы создать область интереса размером один миллиметр на один миллиметр в верхней части экрана.
Перетащите и расположите область интереса в месте с наиболее четко выраженными капиллярными петлями. Убедитесь, что область интереса размещена таким образом, чтобы вершины капиллярных петель находились в самой верхней части области. Ключом к воспроизводимости и стандартизации этого этапа протокола является правильное размещение квадратной области интереса размером 1 мм².
Хорошим эмпирическим правилом для обеспечения стандартизации является размещение рамки в области верхушки или кончика капиллярных петель на изображении. После правильного позиционирования выберите область интереса (ROI), затем в появившемся выпадающем меню выберите функцию «crop» (обрезка), после чего выполните операцию «flatten» (сведение слоев), чтобы все последующие корректировки равномерно применялись ко всему изображению. Далее увеличьте контрастность изображения до 75, чтобы обеспечить максимальную визуализацию капилляров.
Также примените фильтр подавления спеклов (de-speckle) к изображению, чтобы сгладить края капилляров. Завершите настройку контрастности изображения, отрегулировав гистограмму в соответствии с наиболее подходящей моделью, чтобы капилляры были черными, а фон — белым. На каждом изображении вручную выберите участок четко выраженного капилляра, используя функцию целевого объекта (target object), чтобы программа могла распознать их как объекты для подсчета.
Затем с помощью функции фона выберите небольшой участок фона в качестве эталона для областей, которые алгоритм подсчета должен игнорировать. Установите минимальный диаметр подсчитываемых объектов на уровне пяти пикселей, чтобы избежать принятия фонового шума за капилляры. После этого используйте функцию подсчета, чтобы мгновенно определить количество всех капилляров на изображении для каждого отдельного образца.
Для получения более надежной оценки рассчитайте среднее значение по трем-четырем изображениям. Чтобы сэкономить время, создайте макрос для автоматического выполнения определенной последовательности операций с одним или несколькими изображениями: сначала выберите «record macro» и присвойте макросу имя на основе этапов и процессов, выполняемых и описанных в данном видео. Затем выполните шаги по манипулированию изображением, пока идет запись макроса.
При использовании макроса для последующих изображений достаточно нажать «запустить макрос», и программа автоматически применит записанные улучшения к нужным снимкам. Единственным этапом, требующим ввода данных пользователем, является выбор области обрезки изображения. Оптимально обработанное изображение можно подсчитать в течение 30 секунд, при этом капилляры четко отделяются от фона, а также друг от друга.
Здесь представлено окончательное улучшенное изображение. Общее количество, определенное для данного изображения, составило 54 капилляра на квадратный миллиметр. После освоения данной методики с ее помощью можно количественно оценить и обработать 12 изображений за 20 минут.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Капилляроскопия представляет собой неинвазивный метод визуализации капилляров микроциркуляторного русла. В данной статье представлен надежный протокол количественного анализа капилляров с использованием стандартизированного алгоритма.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микроциркуляция
- Визуализация капилляров
- Сердечно-сосудистые исследования
Теоретические основы
- Капилляроскопия позволяет осуществлять прямое наблюдение за капиллярами.
- В предыдущих исследованиях данные о надежности программного обеспечения для количественного анализа капилляров были ограниченными.
- Этот метод имеет решающее значение для понимания микроциркуляции при различных заболеваниях.
- Количественная оценка капилляров может дать представление о таких состояниях, как гипертония и сахарный диабет.
Цель исследования
- Разработать простой и надежный протокол для капиллярного количественного анализа.
- Углубить понимание морфологии и количества капилляров.
- Устранить недостатки в существующих методологиях анализа капилляров.
Используемые методы
- Сделайте монохромный снимок ногтевого ложа под кутикулой.
- Импортируйте изображение в программу для обработки изображений на компьютере.
- Обработайте изображение для лучшей визуализации капилляров.
- Идентифицируйте и подсчитайте количество капилляров в пределах определенной области (1 mm²).
Основные результаты
- Данный протокол позволяет проводить точный количественный анализ капилляров.
- Обработка изображений улучшает визуализацию морфологии капилляров.
- Этот метод может быть применен для изучения влияния заболеваний на микроциркуляцию.
- Результаты могут быть использованы в сердечно-сосудистых исследованиях и клинической практике.
Выводы
- Разработанный протокол надежен и прост в реализации.
- Он предоставляет ценные данные для понимания микроциркуляции.
- Данный метод может помочь в оценке различных сердечно-сосудистых заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Стандартизированное количественное определение плотности капилляров с помощью компьютеризированной капилляроскопии ногтевого сгиба отвечает критической потребности в воспроизводимой оценке микроциркуляторного русла в рамках ранних этапов поиска и трансляционных исследований. Данный метод снижает субъективность и утомляемость оператора, обеспечивая надежную количественную оценку микроциркуляции, что имеет важное значение для моделирования заболеваний и валидации мишеней. Его воспроизводимость и эффективность способствуют принятию обоснованных решений на ключевых этапах разработки препаратов для лечения сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает объективную количественную оценку микрососудистых изменений для проверки гипотез в моделях заболеваний.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней, предоставляя стандартизированные показатели микроциркуляции.
- Способствует снижению механических рисков за счет уменьшения предвзятости оператора при оценке плотности капилляров.
- Повышает прогностическую достоверность при предварительном отборе портфеля проектов на ранних стадиях в области сосудистых и метаболических исследований.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные, воспроизводимые анализы на основе изображений для последующего скрининга соединений.
- Стандартизирует измерение плотности капилляров, повышая воспроизводимость и масштабируемость анализа.
- Обеспечивает количественные результаты, подходящие для сравнения данных между различными исследованиями и центрами.
- Обеспечивает возможность быстрого полуавтоматизированного анализа для подготовки к высокопроизводительному скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Согласует количественную оценку микрососудистого русла с конечными точками, имеющими значение для заболевания, для разработки трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации за счет внедрения согласованных протоколов измерения.
- Поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков на основе надежных данных о микроциркуляции.
- Снижает трансляционную неопределенность, связывая количественные показатели капилляров с фенотипами заболеваний.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод компьютеризированной капилляроскопии интегрирован в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая как проверку ранних гипотез, так и согласование трансляционных биомаркеров.
- Фундаментальная биология: способствует воспроизводимому тестированию гипотез и уточнению путей в исследованиях микрососудистой сети.
- Скрининг: обеспечивает получение стандартизированных количественных данных о плотности капилляров для разработки анализов и оценки соединений.
- Аналитика: позволяет проводить объективное статистическое сравнение изменений микрососудистой сети в различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: поддерживает согласование биомаркеров и преемственность моделей in vitro и in vivo в случаях, когда микроциркуляция является значимым конечным показателем.
- Корпоративное использование: предлагает масштабируемый полуавтоматизированный рабочий процесс, который может быть адаптирован для различных моделей заболеваний и исследовательских групп.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает неопределенность механизмов в микрососудистых исследованиях.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированное, воспроизводимое и быстрое количественное определение с минимальными требованиями к обучению.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет предоставления надежных количественных конечных точек.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию с учетом рисков и продвигать программы по изучению сосудистых и метаболических заболеваний.
Особенности реализации
- Требуется базовый опыт в области цифровой визуализации и интерпретации данных капилляроскопии.
- Необходим доступ к монохромным цифровым камерам и совместимому программному обеспечению для анализа изображений.
- Для обеспечения воспроизводимости требуется межгрупповая стандартизация сбора изображений и размещения ROI.
- Метод применим к различным моделям заболеваний, где микроциркуляция является релевантной конечной точкой.
- Ручной выбор ROI остается потенциальным источником вариабельности и требует строгого соблюдения протокола.
