Методы подавления бактериального Pyomelanin Производство и определить соответствующую увеличению чувствительности к окислительному стрессу

Общие цели следующих экспериментов заключаются в определении влияния NTBC на выработку P melanin и чувствительность к окислительному стрессу, а также на минимальные ингибирующие концентрации (МИК) антибиотиков. Это достигается путем добавления NTBC в бактериальные культуры для определения концентрации, которая снижает выработку p melanin, в качестве второго этапа. Бактериальные культуры обрабатывают NTBC и антибиотиками, что позволит пользователю определить, влияет ли обработка NTBC на МИК антибиотиков.

Затем культуры, обработанные NTPC, подвергают воздействию перекиси водорода для определения чувствительности к окислительному стрессу. Результаты обработки NTPC показывают, что воздействие NTPC на генетически модифицированные бактерии приводит к снижению выработки пигмента и повышению чувствительности к окислительному стрессу, при этом не оказывая влияния на МИК антибиотиков, что было установлено с помощью спот-пластинок для анализа ответа на окислительный стресс и микротитрационных анализов МИК соответственно. Основным преимуществом метода спот-пластинок для анализа окислительного стресса по сравнению с существующими методами, такими как подсчет жизнеспособных клеток и метод диффузии в агар, является возможность использования более низких концентраций перекиси водорода по сравнению с высокими концентрациями, применяемыми в других анализах. Как правило, специалисты, впервые использующие наш метод определения МИК антибиотиков, сталкиваются с трудностями, так как недостаточная точность техники пипетирования приводит к вариабельности между повторностями.

Эта вариабельность может затруднить точное определение МПК антибиотика. За один день до проведения анализа МПК приготовьте культуры тестируемых штаммов в среде LB с добавлением и без добавления.

2,4-динитро-4-триэтилбензоил-1,3-циклогександион, или NTBC. В данной демонстрации используется репрезентативная концентрация NTBC 300 µM. Метод титрования для определения подходящей концентрации NTBC описан в тексте протокола; инкубируйте культуры в течение ночи при 37 °C с аэрацией, после чего приступите к работе на следующий день.

Приготовьте основные растворы LB с NTBC и LB с DMSO для анализа МИК, чтобы протестировать один антибиотик для одного штамма: добавьте NTBC в концентрации 600 µM к 2 мл среды LB и перемешайте. Для приготовления основного раствора NTBC используется концентрация 600 µM, так как при добавлении инокулята раствор будет разбавлен вдвое.

Добавьте эквивалентный объем растворителя DMSO к двум миллилитрам LB, чтобы получить конечную концентрацию 300 micromolar, и перемешайте для приготовления основного раствора NO NTBC. Эти два основных раствора будут использоваться для создания стоковых растворов антибиотиков, а также для постановки серий разведений в 96-луночных планшетах. Затем приготовьте растворы антибиотиков в основных растворах LB плюс NTBC или LB плюс DMSO.

Приготовьте стоковый раствор гентамицина с NTBC или без него в концентрации 64 µg/mL. Приготовьте стоковый раствор канамицина с NTBC или без него в концентрации 256 µg/mL. Приготовьте стоковый раствор тобрамицина с NTBC или без него в концентрации 8 µg/mL.

После приготовления двухкратных растворов антибиотиков внесите по 100 µL каждого раствора антибиотика в четыре лунки ряда A 96-луночного планшета. Например, гентамицин следует внести в лунки с 1 по 4, канамицин — с 5 по 8, а тобрамицин — с 9 по 12. Добавьте по 50 µL основного раствора LB с NTBC или LB с DMSO в ряды с B по H 96-луночного планшета; убедитесь, что один планшет содержит LB с NTBC, а другой — LB с DMSO. С помощью микропипетки выполните двукратные серийные разведения антибиотиков, перенося по 50 µL раствора из ряда A в ряд B. Перемешайте раствор, замените наконечник пипетки и перенесите 50 µL раствора из ряда B в ряд C. Повторите процедуру для остальных рядов до разведения ряда G. Из последнего ряда удалите и утилизируйте 50 µL раствора.

Используйте ряд H в качестве контроля роста бактерий без антибиотиков. Извлеките ночные культуры; после промывки всех культур для удаления ланина, присутствующего в среде, измерьте OD 600 культур, затем разведите ночные культуры в lb, используя многоканальный микропипетчик.

Добавьте по 50 µL разведенной бактериальной культуры в соответствующие лунки. Внесите бактерии в три лунки для каждого штамма и концентрации антибиотика. В четвертую лунку добавьте 50 µL среды LB в качестве контроля бактериального загрязнения.

Накройте 96-луночные планшеты парафильмом и инкубируйте при 37 °C в течение приблизительно 24 часов до следующего дня. Визуально осмотрите планшеты на предмет роста бактерий в лунках. МПК — это наименьшая концентрация антибиотика, при которой не наблюдается роста бактерий во всех трех повторностях для каждого штамма.

Для начала данной процедуры подготовьте ночные культуры исследуемых штаммов в среде LB с добавлением и без добавления NTBC, как было показано ранее. На следующий день приготовьте LB APL, содержащие перекись водорода в качестве окислительного стрессора. Сначала расплавьте LB-агрофлаконы и охладите среду до температуры примерно 50 °C при комнатной температуре.

Затем добавьте перекись водорода непосредственно в охлажденную среду в желаемых концентрациях. Вращайте колбу, чтобы получить диапазон концентраций перекиси водорода от нуля до единицы. Миллимолярная концентрация является подходящей отправной точкой.

Немедленно разлейте среду по чашкам и обдайте поверхность пламенем горелки, чтобы удалить пузырьки воздуха. Выход составляет четыре чашки на 100 milliliters LB-агара. Маркируйте чашки, указав концентрацию перекиси водорода.

Поместите открытые планшеты в биологический бокс при работающем вентиляторе на 30 минут, чтобы удалить излишки влаги с поверхности. Планшеты следует использовать в тот же день. Пока планшеты сохнут, выполните промывку и измерения.

Приведите значения OD 600 всех ночных культур к минимальному значению OD 600 из набора тестируемых штаммов. Для этого определите объем культуры, необходимый для ее разведения до минимального значения OD 600 в общем объеме один миллилитр. Например, если культура имеет OD 600, равный трем, а минимальное значение OD 600 для набора штаммов составляет 2,5, выполните следующий расчет, в результате которого объем необходимой культуры составит 0,833 миллилитра; поместите 0,833 миллилитра культуры в микроцентрифужную пробирку.

Затем рассчитайте объем среды LB с NTBC или LB с DMSO, необходимый для доведения общего объема культуры до одного миллилитра. В данном примере этот объем составит 0,167 мл. Перемешайте смесь с помощью вортекса. Чтобы поддерживать постоянную концентрацию NTBC или DMSO в культурах, выполните десятикратное серийное разведение нормализованных ночных культур в PBS с NTBC или PBS с DMSO. Приготовьте стоковые растворы PBS с NTBC и PBS с DMSO, увеличивая или уменьшая объем в зависимости от количества тестируемых штаммов. Для одного набора разведений одного штамма смешайте 300 мкМ NTBC или эквивалентный объем DMSO с PBS до общего объема 720 мкл. Добавьте по 90 мкл PBS с NTBC или PBS с DMSO в соответствующие микроцентрифужные пробирки, промаркированные для серийного разведения от 10⁻¹ до 10⁻⁷.

Добавьте 10 µL культуры в соответствующую пробирку для разведения 10⁻¹, перемешайте на вортексе, затем перенесите 10 µL разведения 10⁻¹ в пробирку для разведения 10⁻². Меняя наконечники пипетки между этапами разведения, повторяйте процедуру до завершения всех разведений. Нанесите по 5 µL разведений от 10⁻³ до 10⁻⁷ в двух повторах на чашки с LV и пероксидом водорода.

Для каждого штамма используйте отдельный наконечник дозатора. Если споттинг проводится от наиболее разведенных проб к наименее разведенным, не наклоняйте и не переворачивайте планшет до полного высыхания жидкости на поверхности. Инкубируйте планшеты при 37 °C от 24 до 48 часов в зависимости от штамма.

После появления колоний достаточного размера сфотографируйте чашки с помощью ПЗС-камеры, расположенной над транслюминатором. Титрование NTBC использовали для того, чтобы определить, способен ли NTBC снизить выработку п-меланина у p aerogen, и установить концентрацию NTBC, которая устраняет или снижает выработку п-меланина, для использования в дополнительных анализах, представленных здесь. NTBC снижал выработку PY-меланина дозозависимым образом у продуцентов п-меланина, но не оказывал влияния на выработку пигмента в штаммах, не вырабатывающих п-меланин.

В этой таблице представлены результаты определения МИК для различных штаммов p aerogen, обработанных NTBC или не обрабатываемых им, а также различными антибиотиками; значения МИК фиксировались как самая низкая концентрация антибиотика, подавляющая рост бактерий. Обработка NTBC не повлияла на МИК антибиотиков для протестированных штаммов. Для оценки ответа на окислительный стресс был проведен анализ методом спот-планшета (spot plate assay) с использованием меланин-продуцирующих и немеланин-продуцирующих штаммов PIO, обработанных и не обрабатываемых NTBC.

Планшет с нулевой миллимолярной концентрацией перекиси водорода показал, что все штаммы были разведены правильно; при этом наблюдалось повышение чувствительности к окислительному стрессу, когда бактерии, вырабатывающие PIO-меланин, подвергались воздействию NTBC. Штаммы, не вырабатывающие PIO-меланин, оказались более чувствительными к окислительному стрессу, чем штаммы, вырабатывающие p-меланин. После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как определить влияние обработки NTBC на выработку PIO-меланина путем тестирования чувствительности к окислительному стрессу и определения МПК антибиотиков.