Мышь Круглый окно подход к ототоксичных агента доставки: быстрое и надежная техника для индукции Cochlear Cell дегенерации

Общая цель данной процедуры заключается в создании модели повреждения внутреннего уха путем стратегического введения ототоксических агентов непосредственно в нишу круглого окна улитки мыши. Это достигается путем предварительного рассечения слоя подкожного жира и осторожного отодвигания мышечного массива для обнажения надкостницы барабанной буллы. Вторым этапом является вскрытие буллы путем постепенного удаления фрагментов кости до тех пор, пока не будет обнажена ниша круглого окна.

Затем видимая жидкость из среднего уха и ниши круглого окна полностью удаляется для обеспечения оптимальной визуализации ниши круглого окна. Заключительный этап заключается в заполнении ниши круглого окна выбранным ототоксичным агентом, не повреждая при этом ствол поверхностной височной артерии (STA), с последующим повторением процедуры в соответствии со спецификациями агента. В конечном итоге для подтверждения селективного сохранения или дегенерации микроархитектоники улитки применяются функциональные методы, включая регистрацию вызванных слуховых стволовых ответов, и морфологическая оценка.

Основным преимуществом данной методики, которая используется в нашем исследовании, является то, что эта процедура обеспечивает отличный доступ к окну круглого окна, что позволяет прицельно вводить селективный ототоксический агент. Преимущества данного метода включают сохранение микроархитектуры внутреннего уха, отсутствие системной токсичности, быстрое наступление эффекта, селективную дегенерацию определенных типов клеток улитки и воспроизводимость результатов. Данную методику можно применять с незначительными изменениями и для других видов грызунов, включая крыс, морских свинок и песчанок.

Теперь я продемонстрирую эту процедуру в моей лаборатории. Все аспекты исследований на животных проводились в соответствии с рекомендациями соответствующего институционального комитета по уходу за животными и их использованию. Все описанные здесь экспериментальные процедуры на позвонках были одобрены в соответствии с правилами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Медицинского университета Южной Каролины.

После проведения анестезии животного в соответствии с утвержденными процедурами введите предоперационный анальгетик в дозе 0,1 мг/кг. В данном случае используется бупренорфин. Убедитесь, что животное достигло хирургического уровня анестезии.

Реакция на щипок за палец должна отсутствовать, и рефлекс правки у мышей, как показано здесь, должен быть выражен недостаточно. Наберите 0,2 мл водного раствора выбранного ототоксического агента в туберкулиновый шприц объемом один миллилитр, оснащенный затупленной иглой 28-го калибра длиной в полдюйма; удалите весь воздух из шприца, так как пузырьки могут помешать правильному введению препарата. Используйте электрический триммер для удаления шерсти в области от затылочной складки до плечевого пояса.

Расширьте зону удаления шерсти от дорсальной сагиттальной срединной линии латерально до угла нижней челюсти. Используйте одноразовый станок, чтобы обеспечить чистое бритье. Стерилизуйте кожу в подготовленной области согласно протоколам вашего учреждения.

Здесь Бетадин попеременно с этанолом наносят местно круговыми движениями в течение двух минут. Поместите под тело небольшую грелку для поддержания температуры тела животного. При температуре от 36 до 38 °C зафиксируйте голову животного с помощью устройства для удержания головы.

Осторожно затяните небольшой зажим на переносице животного, чтобы зафиксировать его. Убедитесь, что держатель для головы жестко прикреплен к центру U-образного шарнирного рычага. Закрепите стержень шириной один сантиметр на левом плече U-образного рычага в качестве левого подголовника, чтобы обеспечить доступ к правой стороне.

После надежной фиксации в головном держателе поверните мышь в левое боковое положение. Осторожно расположите тело на плоской операционной поверхности, чтобы обеспечить стабильность в течение всей процедуры и избежать избыточного торсионного напряжения шейных позвонков. Над операционным полем установите операционный микроскоп с возможностью увеличения 10 x и 20 x.

Убедитесь, что микроскоп может сохранять свое положение в режиме свободного управления, чтобы обе руки могли быть задействованы в хирургической операции при работе под микроскопическим увеличением. Используя острые ножницы или лезвие скальпеля, сделайте заушный разрез длиной от 1 до 1,5 см примерно в 6–8 мм каудальнее ушного цефалического изгиба. Избегайте глубокого рассечения, чтобы сохранить подлежащие сосудистые структуры.

Выполните тупую диссекцию через слой подкожного жира. При диссекции в вентро-медиальном направлении будьте осторожны, чтобы не повредить наружную яремную вену. В случае кровотечения используйте рассасывающийся желатин, губки или хлопковые тампоны для остановки кровотока.

После того как жировой слой будет надлежащим образом разделен, обнажите мышцы шеи. Важным ориентиром является небольшая ветвь XI пары черепных нервов, которая огибает задний край сосности. Чтобы расширить обзор в направлении ушной раковины, используйте самодержащий ретрактор для осторожного отведения тела сосности мышцы в заднем направлении.

Осторожно раздвиньте прозрачную фасцию, обволакивающую тело мышцы. Также аккуратно отведите околоушную слюнную железу и наружную яремную вену в противоположную сторону. При достаточном раздвигании тела m. CTO Masto виден блестящий купол надкостницы барабанной буллы с медиальной стороны буллы, в месте прикрепления более глубокой шейной мышцы.

В поле зрения появится грудинно-сосцевидный отросток. Установите самофиксирующийся ретрактор для разведения тканей области сосцевидного отростка, используя двухручную технику; осторожно примените биполярную диатермию, чтобы рассечь надкостницу буллы и обнажить подлежащую кость. Затем с помощью пинцета или отологического крючка осторожно приподнимите и отодвиньте надкостницу в периферическом направлении, чтобы полностью обнажить купол буллы.

Теперь с помощью стоматологического режущего бора с конусным наконечником диаметром один или два миллиметра осторожно просверлите направляющее отверстие диаметром два миллиметра сквозь кость барабанной полости. Сверление следует проводить между медиальным краем купола и видимой непрозрачной линией, проходящей по ростральной стороне барабанной полости. Затем осторожно просверлите второе направляющее отверстие рядом. Для облегчения удаления крышки кости барабанной полости с помощью ювелирного пинцета с тонкими кончиками отслоите кость барабанной полости в дорсальном и медиальном направлениях.

Будьте осторожны, чтобы не повредить артерию EDL, которая проходит непосредственно под костным выступом. Минимизируйте объем удаляемой кости, чтобы предотвратить чрезмерное попадание жидкости в среднее ухо до введения препарата. Используйте бумажный фитиль, чтобы удалить всю видимую жидкость из среднего уха и ниши круглого окна до тех пор, пока не станет видна сухая кость.

Этот этап имеет решающее значение для успеха протокола. Рассматривая область под максимальным увеличением, используйте иглу малого калибра одномиллилитрового туберкулинового шприца, чтобы нанести одну каплю ототоксического агента непосредственно в нишу круглого окна, полностью заполняя ее. Оставьте агент в нише круглого окна на 10 минут.

На ранних этапах внимательно следите за тем, чтобы небольшое световое отражение у основания сухой ниши сменилось матовым и туманным мениском жидкости. Это указывает на то, что ниша заполняется правильно. По истечении 10 минут полностью удалите агент с помощью фитиля и нанесите его повторно.

Количество нанесений зависит от используемого средства. Время экспозиции обычно составляет от 30 до 60 минут. После последнего нанесения оставьте булль открытой и с помощью пинцета сомкните мягкие ткани над местом хирургического вмешательства.

Для ушивания кожи над местом хирургического вмешательства используйте нерассасывающуюся монофиламентную шовную нить 4-0. Дайте животному восстановиться после наркоза в чистой домашней клетке, оснащенной подстилкой и мягким кормом. Ежедневно наблюдайте за животными до момента эвтаназии и забора тканей улитки у взрослых особей C-B-A-C-A-J.

Мыши обоих полов подвергались воздействию ототоксического агента Hept (этанол) путем диффузии через круглое окно. Значительное повышение порогов BR наблюдалось у мышей, получавших Hept, с первого по четырнадцатый послеоперационный день по сравнению с животными контрольной группы, которым проводилась имитация операции с введением физиологического раствора вместо Hept.

Этанол не вызвал значимых сдвигов порога слышимости ни на одной из протестированных частот. Иммуноокрашивание на внутренне выпрямляющий калиевый канал (показано зеленым цветом) служило косвенным методом визуализации повреждения и восстановления структур улитки. Интенсивность окрашивания была заметно снижена в области theria vais.

На первый послеоперационный день при окрашивании ядер (показано красным цветом) также наблюдались признаки нарушения целостности ядер и конденсации хромосом, типичные для апоптоза клеток. При количественном определении интенсивности окрашивания калиевых каналов в областях ушных раковин, подвергнутых воздействию стратиса, был выявлен первоначальный спад с последующим значительным сдвигом в сторону интенсивности контрольной группы через семь дней после воздействия гепта, после чего восстановление продолжалось.

Важно помнить, что дополнительное воздействие или восполнение объема могут помочь избежать нежелательного разбавления аутотоксического агента конденсатом крови или интерстициальной жидкостью. Однако при таком подходе следует соблюдать осторожность, так как это может повысить риск непреднамеренного повреждения улиточной артерии или попадания интерстициальной жидкости в нишу круглого окна. Этот малоинвазивный метод позволяет детально изучать тонкие биохимические процессы и сыграл ключевую роль в продвижении наших исследований, направленных на понимание регенеративного потенциала улитки in vivo.