Измерение ТКР ПКИКЖ Связывание

В этом видео мы продемонстрируем, как измерять кинетику взаимодействия между Т-клеточным антигенным рецептором и главным комплексом гистосовместимости, нагруженным пептидом (pMHC), в контексте иммунологического синапса между Т-клеткой и плоским поддерживаемым липидным бислоем. Мы кратко опишем важные аспекты получения белков и проверки функциональной целостности липидного бислоя с помощью измерений потока ионов кальция. Для получения более подробной информации о подготовке липидного бислоя и настройке одномолекулярного флуоресцентного микроскопа, пожалуйста, обратитесь к нашей параллельной публикации в Journal of Visualized Experiments. Затем мы подробно объясним, как проводить и анализировать измерения фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET) как в совокупности, так и на одномолекулярном уровне.

Чтобы определить кинетику связывания синаптического Т-клеточного рецептора с PMHC для обоснования нашей стратегии на основе FRET, используемой в общем подходе, мы начнем с кристаллической структуры Т-клеточного рецептора (TCR), обозначенного здесь синим цветом, в момент связывания с его антигеном — молекулой MHC, нагруженной пептидом (PMHC), показанной желтым и красным цветами. Мы также вводим одноцепочечный фрагмент вариабельных доменов антитела, реагирующего с бета-цепью Т-клеточного рецептора, названного age 57. Для количественных измерений на основе FRET обязательно специфическое по сайту мечение как донора FRET (в нашем случае — одноцепочечного фрагмента), так и акцептора FRET (PMHC).

Это осуществимо для рекомбинантных белков путем введения свободной цистеиновой кислоты, которая затем может быть ковалентно связана с конъюгированным флуорофором. Как показано, мы прикрепляем FRET-донор Alexa Fluor 555 или Cy3 к одноцепочечному фрагменту, а FRET-акцептор Alexa Fluor 647 или Cy5 — к C-концу пептида, связанного с MHC.

Расстояние между индексами, показанное в этой композитной структуре, составляет около 41 angstrum, что даже меньше первого радиуса — расстояния половины максимального переноса энергии между двумя красителями. В наших экспериментах мы используем плоские липидные бислои на стеклянной подложке в качестве суррогатных антигенпрезентирующих клеток. Они функционализированы PMXC, молекулой атактора B7-1 и молекулой адгезии ICAM-1.

Таким образом, визуализацию можно проводить в режиме флуоресценции с полным внутренним отражением, при котором освещается флуорофор в непосредственной близости от интерфейса, что существенно снижает клеточный фон. Fret обнаруживается только тогда, когда меченные одноцепочечные фрагментные TCR взаимодействуют с встроенными в слой pMHC. Это позволяет нам визуализировать связывание TCR-pMHC и затем рассчитать кинетику связывания в C с правильно свернутым гистогенным тактом.

Внеклеточные участки P71 и I-chem-1 очищают из супернатантов культур клеток насекомых, инфицированных соответствующим вирусом BUC. Очистка проводится в три этапа, начиная с аффинной хроматографии на никеле, за которой следует ионообменная и эксклюзионная хроматографии. Гетеродимеры MHC II класса с His-тегом экспрессируют в E. coli в виде тель-включений и рефолдируют in vitro при 4 °C в присутствии пептида-заполнителя путем быстрого разбавления в редокс-буфере.

Пептид-заполнитель будет впоследствии расщеплен путем воздействия УФ-излучения. Правильно свернутые комплексы PMHC очищают и концентрируют вместе с пептидом-заполнителем. При pH 5.2 пептид расщепляется и заменяется флуоресцентным пептидом.

Конечный продукт очищен методом эксклюзионной хроматографии. Одноцепочечный фрагмент экспрессируется с незанятым цистеином в виде телец включений в e coli, после чего подвергается рефолдингу in vitro посредством ступенчатого диализа и очистке по размеру. Затем он метится через незанятый цистеин красителем, конъюгированным с малеимидом, и снова очищается методом эксклюзионной хроматографии.

Все рекомбинантные белки в конечном итоге подвергают диализу против PBS, содержащего 50% глицерина, концентрируют до 1 mg белка на mL и хранят в течение длительного времени при -20 °C. Для измерения уровней внутриклеточного кальция в Т-клетках с целью подтверждения стимулирующей способности липидных тел используйте рациометрический краситель URA-2. Загрузите Т-бласты эфиром URA-2.

Это соединение проникает в клетки благодаря своей AM-группе, после чего задерживается внутри под действием эстераз, которые отщепляют AM-часть. Добавьте fira 2:00 AM примерно к 3 миллионам Т-клеток до конечной концентрации 5 µM на литр. Перенесите клетки из 24-луночного планшета в новую пробирку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.

Однократно промойте клетки в буфере для визуализации, содержащем сбалансированный солевой раствор Хэнкса с добавлением кальция и магния и 1% альбумина. Для мониторинга внутриклеточного кальция используйте автоматизированную систему инвертированного микроскопа с возможностью УФ-возбуждения. Запустите протокол отсчета времени и добавьте несколько загруженных Т-клеток в функционализированный липидный бислой, расположенный в фокусе на предметном столике микроскопа; через регулярные интервалы времени регистрируйте DIC-изображение и два флуоресцентных изображения, возбужденных УФ-светом с длиной волны 340 и 380 нанометров.

Сразу после установления контакта с бислоем в Т-клетках наблюдается повышение уровня кальция, что фиксируется по соотношению URA через 15 минут после начала эксперимента. Добавьте к клеткам блокирующие антитела, которые насыщают все антигены PMHC. В результате внутриклеточный уровень кальция снизится до значений, характерных для неактивированного состояния, которые в дальнейшем будут служить эталоном.

Как только уровни присутствия блокирующих антител снизятся до значения, отражающего неактивированное состояние (которое мы принимаем за единицу для измерений FRET), Т-клетки необходимо окрасить FRET-зондом на основе одноцепочечного фрагмента, реагирующего с TCR. Для каждого эксперимента перенесите около 1 миллиона клеток в пробирку и центрифугируйте при 400 G. Слейте среду и удалите оставшиеся капли среды, прилипшие к внутренним стенкам, с помощью бумажного полотенца. Это обеспечит минимальный объем инкубации около 30 мкл, о котором упоминалось ранее.

Зонд FRET хранится в концентрации 1 mg/mL в 50% глицерине при температуре -20 °C. Он специфически мечен либо Alexa Fluor 488, либо Alexa Fluor 555, либо Alexa Fluor 647 при соотношении краситель/белок 1:1. Добавьте 0,3 µL зонда к клеткам. Осторожно несколько раз встряхните осадок и инкубируйте клетки в течение 20 минут на льду.

Промойте клетки ледяным имиджинг-буфером. Повторите данную процедуру промывки один раз. Инкубация, центрифугирование и хранение при низкой температуре гарантируют, что T-клетки не будут интернализировать флуоресцентный зонд во время воздействия на них.

Это привело бы к повышенному уровню фоновой флуоресценции. Более того, Т-клетки не теряют зонд при низких температурах во время промывки и хранения перед помещением бислойной камеры на сменный столик микроскопа. При последовательной замене PBS на буфер для визуализации любой ценой избегайте контакта бислоя с воздухом, так как это приведет к его разрушению.

Для снижения клеточного фона мы используем освещение по типу «турф» (turf illumination). Для этого мы направляем возбуждающий луч под критическим углом, при котором происходит полное внутреннее отражение. Выключите возбуждение, включите широкий свет, поместите T-клетки в камеру ltec и дайте им осесть на липидный слой.

Включите возбуждающее излучение и сфокусируйтесь на области вне «дерна» (turf). Клеточная мембрана наблюдается в виде кольца вдоль оптической оси в каждой фокальной плоскости; в области «дерна» видна только базальная мембрана, контактирующая с бислоем. Плоскости выше больше не возбуждаются и, следовательно, не видны.

Протокол синхронизации начинается с красного и зеленого импульсов возбуждения для визуализации PMHC и TCR, за которыми следует красный импульс обесцвечивания для абляции акцептора P-M-H-C-F. Зеленый импульс для визуализации TCR после обесцвечивания акцептора F и красный импульс для подтверждения абляции акцептора F выполняются в субсекундном временном масштабе с максимально коротким интервалом между первым и вторым зелеными импульсами. Опционально в начале может быть получено DIC-изображение; разделение двухцветного изображения позволяет одновременно регистрировать каналы донора и акцептора.

Возбуждение акцептора в этой группе демонстрирует накопление pMHC в синапсе T-клетки. Это предварительное изображение подтверждает наличие pMHC и указывает на уже произошедшее связывание pMHC, опосредованное TCR. Донор в этой группе дает изображения в обоих каналах.

Сигнал канала донора FED в некоторой степени снижается по интенсивности из-за переноса энергии в канал акцептора FRET. Сигнал канала акцептора FRET состоит из перетекания сигнала (bleed-through) донора FED и перекрестного возбуждения акцептора FRET. В любом случае, это изображение не будет использоваться для анализа.

В данном протоколе следует этап быстрого обесцвечивания, который устраняет весь принятый F-акцепторный флуоресцентный сигнал. Интенсивность изображения F-донора после приемлемого обесцвечивания теперь восстанавливается до более высоких уровней без потери интенсивности в канале FRET.

Следующее ожидание акцептора FRET подтверждает полное выгорание акцептора F. Давайте увеличим масштаб синапса, чтобы количественно оценить восстановление донора FRET. Определите среднюю интенсивность фона, которая остается постоянной независимо от акцептора FRET.

Затем проводят фотообесцвечивание и определяют среднюю интенсивность синапса, а также интенсивность репрезентативного кластера TCR. Выход FRET рассчитывают путем нормализации разности значений до и после абляции акцептора. В нашем примере мы измерили 16% FRET для всего синапса и 26% FRET для репрезентативного кластера.

Выход FRET-кластеров TCR впоследствии будет преобразован в показатели заполненности TCR, что позволит получить двумерные данные о константе диссоциации синапса для отдельных молекул. Это поможет нам определить кинетику связывания TCR с пептидом MHC в синапсе для экспериментов по FRET-анализу единичных молекул. Мы используем те же реагенты и стратегию маркировки, что и ранее.

Однако, чтобы убедиться, что мы действительно наблюдаем взаимодействие между одним TCR и одним пептид-MHC, мы выбрали следующий критерий. Событие, претендующее на роль FRET одного отдельного молекулярного комплекса, должно быть согласовано с одиночной молекулой-акцептором или донором FRET. В данном случае мы используем один PMHC в качестве молекулы-акцептора FRET, чтобы подтвердить одномолекулярный характер наблюдаемого события FRET, однако возможен и противоположный подход.

Использование доноров и акцепторов с соответствующими длинами волн возбуждения и эмиссии, безусловно, является возможным вариантом. Обычно мы подвергаем Т-клетки, контактирующие со стимулирующим липидным слоем, воздействию возбуждающего света с длиной волны 514 и 647 нм; последовательное и повторяющееся возбуждение донора и акцептора с минимальной задержкой в одну миллисекунду сменяется временем ожидания, которое может варьироваться в зависимости от требований эксперимента.

Для получения флуоресцентного сигнала достаточной интенсивности для детектирования одного красителя в течение нескольких миллисекунд после возбуждения необходимо применить высокую плотность мощности возбуждения в диапазоне от одного до пяти киловатт на квадратный сантиметр. Из-за фотообесцвечивания число видимых молекул-акцепторов FRET PMHC быстро снижается до уровня, при котором отдельные флуоресцентные силы акцепторов FRET становятся различимыми в бислое, содержащем 30 или более меченных PMCS на квадратный микрон. Здесь приведен пример для общей временной задержки 42 миллисекунды.

Одиночное событие FRET, отмеченное красным кружком, становится видимым во второй и третьей временных точках. Оно колокализуется с одной молекулой S5, отмеченной зеленым кружком. В данном примере наблюдаемое событие FRET имеет длину трассы, равную двум; соберите больше трасс FRET одиночных молекул, как показано в таблице, примерно 128 трасс.

Затем вычислите дополнительную кумулятивную сумму трасс, как показано зелеными цифрами, и нормализуйте их; постройте график нормализованных значений и аппроксимируйте их моноэкспоненциальной функцией. Ожидаемое значение составляет чуть более 1,5 timeframes. Это значение зависит от пептида TCR, связывания с MHC и фотообесцвечивания; чтобы иметь возможность разграничить эти два вклада, ожидаемое значение должно быть рассчитано как минимум для трех разных временных интервалов.

Теперь на графике отложены все ожидаемые значения в зависимости от соответствующих временных задержек, и точки данных аппроксимированы показанной здесь функцией, содержащей время жизни 2,12 seconds. Восстановление донора после приемлемого фотообесцвечивания (PHOTOBLEACHING), как показано здесь и более подробно ранее, может быть использовано для определения всего за несколько шагов двумерных констант диссоциации в их эффективном состоянии внутри иммунологического синапса.

Здесь мы сосредоточим наш анализ на взаимодействии TCR и кластерах TCR, где связывание T-C-R-P-M-H-C наиболее выражено. Как становится очевидно из представленных измерений, значения F FRED существенно варьируют для отдельных кластеров TCR.

Умножение F fred на коэффициент пропорциональности C позволяет определить степень заполнения TCR — величину A, описывающую отношение количества связанных с pMHC TCR к их общему числу. Значение C должно быть определено один раз для конкретного набора пар fre и используемой системы FRE. В конце данной презентации мы более подробно объясним, как определить C; например, этот процесс включает использование SI три и SI пять, нанесенных специфически на реактивный одноцепочечный антительный фрагмент TCR и C-конец связанного с MHC пептида. Это позволяет рассчитать примерно две синаптические двумерные константы диссоциации на основе степени заполнения TCR (A) и начальной плотности pMHC на липидном бислое.

Представленная зависимость выведена из закона действующих масс и более подробно описана в статье, сопровождающей данный фильм. В нашем примере начальная плотность pmcs составляет 30 молекул на квадратный микрон. В результате мы получаем распределение 2D kds, которые эффективно функционируют в синапсе Т-клеток, со значением медианы около 34 молекул на квадратный микрон.

Распределение константы скорости ассоциации может быть рассчитано на основе синаптического двумерного распределения KD и соответствующей константы скорости диссоциации, которая в данном случае составляет 0,41 в секунду, что было определено с помощью анализа трасс FRET одиночных молекул при 24 °C. Медианное значение составляет примерно 0,01 квадратного микрона на молекулу в секунду. Таким образом, измерения FRET между TCR и пептид-MHC позволяют провести всесторонний анализ всех кинетических параметров, описывающих динамику реакции в C two.

В принципе, данную методику можно обобщить для анализа взаимодействий других рецепторов с лигандами, так как они могут играть важную роль в межклеточном распознавании. И наконец, мы обсуждаем, как экспериментально определить константу C, которая необходима для пересчета выхода жиров в степень заполнения TCR. Эту процедуру необходимо выполнить только один раз.

Определенная константа C может затем быть использована во всех последующих экспериментах, в которых применяется та же система FRET с теми же флуорофорами. В данном методе мы, по сути, соотнесли выходы FRET, измеренные в отдельных кластерах TCR с помощью восстановления донора после фотообесцвечивания акцептора, с соответствующими значениями интенсивности, зарегистрированными в сенсибилизированном FRET-канале. Как обсуждалось ранее, выход FRET определяется по изображениям донорного FRET-канала с поправкой на фон до и после абляции акцептора FRET.

Сенсибилизированный канал FRET должен быть выровнен по донорскому каналу F, а также по осям X и Y, и скорректирован с учетом фона. Здесь показаны перетекание сигнала донора FRET и перекрестное возбуждение акцептора FRET. Подробное описание того, как корректировать перетекание сигнала донора FRET и перекрестное возбуждение акцептора FRET, приведено в статье.

В дополнение к данному видео теперь рассчитайте для каждого кластера TCR отношение сигнала bug исправленного изображения FRET и соответствующего исправленного изображения донора FRET. Определите исправленный средний сигнал для одиночных доноров FRET и событий FRET единичных молекул, а затем рассчитайте их отношение. Заполнение TCR затем вычисляется путем перемножения обоих отношений.

Теперь постройте график зависимости выходов FRET, определенных для отдельных кластеров TCR, от степени их заполненности TCR. Затем значение C определяется с помощью линейной регрессии, как показано здесь. В нашем примере оно составляет примерно две.

После просмотра этого видео вы сможете использовать функционализированный белком липидный бислой в сочетании с флуоресцентной микроскопией одиночных молекул для измерения кинетики синаптического связывания между PMHC и TCR. Были подробно рассмотрены все необходимые этапы, включая получение белков, маркировку Т-клеток и финальные измерения FRET. Кроме того, был детально продемонстрирован анализ изображений, позволяющий получить кривые активации Т-клеток и значения FRET.

Наконец, была продемонстрирована методология, лежащая в основе определения кинетических констант скоростей ассоциации и диссоциации. Аналогичный подход в принципе может быть использован для определения взаимодействий других лигандов с синаптическими рецепторами, хотя могут потребоваться соответствующие модификации.