Измерение ТКР ПКИКЖ Связывание На месте С помощью FRET основе микроскопии Пробирной

В этом видео мы покажем, как измерить кинетику между рецептором антигена Т-клеток и основным комплексом гистосовместимости с пептидами или PMHC в С-2, который находится в пределах иммунологического синапса между Т-клеткой и планарным липидным слоем. Мы кратко расскажем вам о важных аспектах производства белка и проверке функциональной целостности липидного слоя с помощью измерений потока кальция. Для получения более подробной информации о том, как получить липидный блей и как настроить флуоресцентный микроскоп с одной молекулой, пожалуйста, обратитесь к нашему параллельному материалу В журнале визуализированных экспериментов мы подробно объясним, как проводить и анализировать измерения первого или резонансного переноса энергии в жуке и на уровне одной молекулы.

Чтобы определить кинетику связывания синаптического Т-клеточного рецептора PMHC и объяснить нашу стратегию, основанную на ладах, используемую в нашем общем подходе, мы начнем с кристаллической структуры Т-клеточного рецептора или TCR, обозначенной синим цветом, когда он связывается со своим антигеном, пептидной молекулой MHC или PMHC, показанной желтым и красным цветами. Мы также вводим фрагмент одной цепи вариабельных доменов из бета-реактивного антитела Т-клеточного рецептора, названного возрастом 57 лет. Для количественных измерений на основе fre обязательным является маркировка как донора fre, в нашем случае фрагмента одной цепи, так и рецептора fre, PMHC специфическим для сайта способом.

Это возможно для рекомбинантных белков путем введения непроветриваемого цистеина, который затем может ковалентно связываться с конъюгированной силой клеща. Как показано, мы присоединяем подаваемый донор Alexa Fluor 5 5 5 или третью сторону к фрагменту одиночной цепи и акцептору ладов. Alexa протекает 6, 4, 7 или SI 5 к С-концу связанного пептида MHC.

Расстояние Инди, как показано в этой составной структуре, составляет около 41 ангструма, что даже меньше первого радиуса, расстояния половины максимальной передачи энергии между двумя красителями. В наших экспериментах мы используем липидный билар с планарной стеклянной поддержкой в качестве суррогатных антигенпрезентирующих клеток. Они функционализированы с помощью PMXC, аториальной молекулы B seven one и молекулы адгезии I chem one.

Таким образом, визуализация может быть выполнена в режиме флуоресценции с полным внутренним отражением, который освещает силу флуоресценции в непосредственной близости от границы раздела, тем самым значительно уменьшая клеточный фон. Лад обнаруживается только тогда, когда отдельные фрагменты цепи, помеченные TCR, вступают в контакт с помощью встроенных слоев PM hc. Это позволяет визуализировать связывание T-C-R-P-M-H-C, а затем рассчитать кинетику связывания в C двух правильно свернутых гистогенах Tact.

Внеклеточные части P 7 one и I chem one очищают от надосадочной жидкости клеточных культур насекомых, инфицированных соответствующим вирусом BUC. Очистка проводится в три этапа, начиная с антиаффинной хроматографии никеля, за которой следует обмен железа и эксклюзионная хроматография. Гетеродимеры Histo tag MHC второго класса экспрессируются в кишечной палочке в виде тел включения и повторно сворачиваются in vitro при четырех градусах Цельсия и присутствии пептида-держателя пространства путем быстрого разведения в окислительно-восстановительном буфере.

Пептид держателя пространства в дальнейшем будет расщеплен под воздействием ультрафиолетового излучения. Правильно сложенные комплексы PMHC после очистки и концентрации пространства держателя. Пептид расщепляется и заменяется при pH 5,2 флуоресцентным пептидом.

Конечный продукт очищается по размеру стенда. Фрагмент одиночной цепи экспрессируется с помощью непроветриваемого цистеина в виде включений в кишечную палочку, свернутых in vitro с помощью ступенчатого диализа и очищенных по размеру. Затем его помечают с помощью непроветрившегося цистеина с помощью конъюгированного красителя и очищают по размеру. Снова.

Все рекомбинантные белки окончательно диализуются на уровень PBS, содержащего 50% глицерина, в концентрации до одного миллиграмма белка на миллилитр, и начинают длительное время при температуре минус 20 градусов Цельсия. Используйте метрическое соотношение URA два красителя для измерения внутриклеточного уровня кальция в Т-клетках в качестве средства проверки стимулирующей активности липидного слоя. Загрузите Т-элементный взрыв эфиром URA 2:00 AM.

Это соединение проникает в клетки через АМ-частицу, но затем оно попадает внутрь под действием эстераз, которые расщепляют АМ-часть. Добавьте фиру за 2:00 до 3 миллионов Т-клеток при конечной концентрации 5 микром МО на литр. Переложите клетки из 24-луночной пластины в новую пробирку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.

Промойте клетки один раз в буфере для визуализации, содержащем буферизованный солевой раствор Хэнкса, включая кальций и магний и 1% альбумина. Для мониторинга внутриклеточного кальция используйте автоматизированную систему инвертированного микроскопа с поддержкой ультрафиолетового излучения. Запустите протокол синхронизации и добавьте меньше двух загруженных Т-клеток к функционализированному липидному бислою, помещенному в фокус на предметном столике микроскопа, получите через равные промежутки времени изображение DIC и два флуоресцентных изображения, возбужденных ультрафиолетовым светом 340 и 380 нанометров.

Сразу после двухслойного контакта Т-клетки принимают повышенный уровень кальция, как это было считывается соотношением URA, через 15 минут после начала бега. Добавьте в клетки блокирующее антитело, которое насыщает все антигены PMHC. Как следствие, внутриклеточный уровень кальция снижается до уровня неактивированного состояния, который в дальнейшем служит ориентиром.

Как только уровень блокирующего антитела в настоящее время снизится до значения, отражающего неактивированное состояние, которое мы нормализуем до единицы для измерения ладов, Т-клетки необходимо окрашивать реактивным одноцепочечным зондом для каждого эксперимента, переносить около 1 миллиона клеток в пробирку и вращать их при 400 G. Сцеживать среду и сливать оставшиеся капли среды. Приклеиваем к внутренним стенкам бумажным полотенцем. Это обеспечивает минимальный объем инкубации около 30 микролитров, о котором я упоминал ранее.

Проп для ладов хранится в концентрации один миллиграмм на миллилитр и 50% глицерина при температуре минус 20 градусов Цельсия. Он специально помечен либо Alexa, либо гриппом 5, 5, 5, а также тремя При соотношении белка дито один на 0,3 микролитра зонда к клеткам. Осторожно взбейте гранулу несколько раз и инкубируйте ячейки в течение 20 минут на льду.

Промойте клетки в ледяном буфере для визуализации. Повторите эту процедуру стирки один раз. Инкубация, центрифугирование, хранение при низкой температуре гарантируют, что Т-клетки не усваивают флуоресцентный зонд во время его воздействия.

Это приведет к повышению фоновой флуоресценции. Кроме того, Т-клетки не теряют зонд на морозе во время промывки и хранения перед помещением биларсодержащей камеры на предметный столик микроскопа. PBS последовательно с буфером для визуализации любой ценой избегает воздействия воздуха на бислой, так как это может привести к его разрушению.

Чтобы уменьшить ячеистый фон, мы используем подсветку газона. Для этого мы располагаем возбуждающий луч под критическим углом, под которым происходит полное внутреннее отражение. Выключите возбуждение, включите широкий свет и добавьте Т-образные элементы в камеру ltec и дайте им осесть на липидный слой.

Включите возбуждение и сфокусируйтесь на освещении вне газона. Клеточная мембрана наблюдается в виде кольца вдоль оптической оси в каждой фокальной плоскости в газоне, наблюдается только базальная мембрана, контактирующая с бислоем. Фокальные плоскости выше больше не возбуждаются и поэтому не видны.

Протокол синхронизации начинается с красного и зеленого возбуждающих ячеек для визуализации PMHC и TCR, за которым следует импульс красного отбеливателя для абляции акцептора P-M-H-C-F. Зеленый импульс для визуализации TCR после обесцвечивания жирового акцептора F и красный импульс для проверки экспериментов по абляции акцептора F выполняются в масштабе времени долей секунды с максимально короткой задержкой между первым и вторым зелеными импульсами. Опционально, изображение DIC может быть получено в начале двух цветных изображений, разделение позволяет одновременно обнаруживать подаваемый донор и канал подаваемого акцептера.

Возбуждение получателем корма показывает накопление P HCS в синапсе Т-клеток. Это предварительное изображение подтверждает наличие PMCS и указывает на уже опосредованное TCR связывание PMHC. Возбуждающий. Подаваемый донор порождает изображения в обоих каналах.

Сигнал подаваемого донорского канала в некоторой степени снижается по интенсивности за счет передачи энергии в канал, принятый F. Сигнал канала, принимаемого ладом, состоит из просачивания лада через подаваемый донор и перекрестного возбуждения акцептора ладов. В любом случае, это изображение не будет использоваться для анализа.

В действующем протоколе. Затем следует быстрый отбеливающий ворс, который устраняет всю допустимую силу флюороса F. Интенсивность изображения донора F Fed после приемлемого для ладов обесцвечивания теперь восстанавливается до более высоких уровней без потери интенсивности в канале fre.

Следующее ожидание приема лад подтверждает полное обесцвечивание жирового акцептора F. Давайте увеличим масштаб синапса, чтобы количественно оценить выздоровление откормленного донора. Определите среднюю интенсивность фона постоянной независимо от акцептора фре.

Затем фотообесцвечивание определяет среднюю интенсивность синапса и интенсивность репрезентативного кластера TCR. Затем предел текучести ладов рассчитывается путем нормализации разницы до и после абляции акцептора f. В нашем примере мы измеряем 16% ладов для всего синапса и 26% ладов для представителя.

Выходы кластера TCR в дальнейшем будут преобразованы в заполняемость TCR, что приведет к получению данных о двумерной синаптической диссоциации одной молекулы. Послужите нам для определения кинетики связывания синаптического пептида TCR MHC для экспериментов с одной молекулой F-угрозы. Мы используем те же реагенты и стратегию работы, что и раньше.

Однако, чтобы убедиться в том, что мы действительно наблюдаем взаимодействие между одним TCR и одним пептидным MHC, мы выбираем соответствие следующему критерию. Событие-кандидат для одной молекулы fre должно быть в разговорной речи с одним акцептором fre или молекулой-донором fre. В данном случае мы используем одну PMHC в качестве молекулы-акцептора fre для проверки одномолекулярной природы наблюдаемого fre-события, но с противоположным рациональным обоснованием.

Использование акцепторов с более высокими пуговицами и донорами Фреда и низкими пуговицами, безусловно, является вариантом. Обычно мы подвергаем Т-клетки контакту со стимулирующим липидным блейком с возбуждением 514 и 647 нанометров, за этим следует легкое последовательное и повторяющееся возбуждение донора и акцептора с минимальным временным лагом в одну миллисекунду, за которым следует время задержки. Это может быть изменено в соответствии с требованиями эксперимента.

Чтобы получить достаточно сильный флуоресцентный сигнал для обнаружения одного кристалла в течение миллисекунд после возбуждения, нам необходимо применять высокую плотность мощности возбуждения в диапазоне от одного до пяти киловатт на квадратный сантиметр. Из-за фотообесцвечивания количество видимых молекул акцептора ладов PMHC быстро падает до уровня, при котором сила флуороприемника одного лада становится различимой в бислое, содержащем 30 или более меченых PMCS на квадратный микрон. Здесь показан пример для общей временной задержки в 42 миллисекунды.

Событие на одном ладу, отмеченное красным кругом, становится видимым во второй и третьей временных точках. Он локализуется с помощью одной молекулы S-5, отмеченной зеленым кружком. В этом примере наблюдаемое событие лада имеет длину следа, равную двум, соберите больше одномолекулярных ладовых дорожек, как показано в таблице, примерно в 128 дорожках.

Затем вычислите комплементарную совокупную сумму трасс, как показано зелеными числами, и нормализуйте их как показано нормализованные значения графика и подгоните их с помощью моноэкспоненциальной функции. Математическое ожидание составляет чуть больше 1,5 таймфреймов. Эта величина зависит от пептида TCR, связывания MHC и фотообесцвечивания, чтобы иметь возможность различать эти два вклада, таким образом, ожидаемое значение должно быть рассчитано по крайней мере для трех различных периодов времени.

Задержки теперь отображают все значения математического ожидания относительно соответствующих временных лагов и подгоняют точки данных к показанной функции, содержащей здесь время жизни. 2.12 секунды и математическое ожидание для PHOTOBLEACHING f Fred. Восстановление донора после приемлемого отбеливания F Fred, как показано здесь и более подробно ранее, может быть использовано для определения двухмерных констант диссоциации всего за несколько шагов, поскольку они эффективны в пределах иммунологического синапса.

Здесь мы сосредоточим наш анализ на вовлечении TCR и кластерах TCR, где связывание T-C-R-P-M-H-C наиболее заметно. Как видно из показанных измерений, урожайность F FRED существенно варьируется. Для отдельных кластеров TCR.

Умножение F fred yield на коэффициент пропорциональности C приводит к заполнению TCR, Термин, описывающий отношение между числом связанных TCR PMHC и их общим числом C, должен быть определен один раз для конкретного набора fre пар и используемой системы FRE. Ближе к концу этой презентации мы более подробно объясним, как определить, например, C, который включает в себя SI three и SI 5, размещенные конкретно на фрагменте реактивного одноцепочечного антитела TCR R и C-конце связанного с MHC пептида. Это составляет около двух синаптических, двумерных констант диссоциации, которые могут быть вычислены из заполняемости TCR, называемой A, и начальной плотности PMC, присутствующих на липидном пузыре.

Показанная взаимосвязь вытекает из закона действия масс и более подробно объясняется в статье, сопровождающей этот фильм. В нашем примере исходная плотность ПМК составляет 30 молекул на квадратный микрон. Мы получаем распределение 2D kds, которые эффективны в синапсе Т-клеток со средним значением около 34 молекул на квадратный микрон.

Распределение скорости включения может быть рассчитано на основе синаптического 2D распределения KD и соответствующей скорости выключения здесь 0,41 в секунду, как определено с помощью анализа следов ладов одной молекулы при температуре 24 градуса Цельсия. Медианное значение составляет около 0,01 квадратного микрона на молекулу в секунду. Таким образом, измерения F-угрозы между TCR и пептидом MHC позволяют провести всесторонний анализ всех кинетических параметров, которые описывают динамику реакции в C-2.

Эта методология в принципе может быть обобщена для анализа других взаимодействий рецепторных лигандов, поскольку они могут быть неотъемлемой частью распознавания клеточных клеток. И последнее, но не менее важное: мы обсудим, как экспериментально получить константу C, которая требуется для преобразования выхода жира в заполняемость TCR. Эту процедуру нужно выполнить всего один раз.

Определенная константа C может быть затем использована для всех последующих экспериментов, в которых применяется та же система ладов с теми же флуор-четверками. В этой процедуре мы ретранслировали, по сути, выход лада, измеренный в отдельных кластерах TCR, через восстановление донора после фотообесцвечивания акцептора до соответствующих значений интенсивности, обнаруженных в сенсибилизированном канале лада. Как обсуждалось ранее, выход лада определяется по скорректированным на фоне изображениям канала донора ладов до и после абляции акцептора ладов.

Сенсибилизированный канал лада должен быть выровнен с донорным каналом F, а также X и Y и скорректирован на фон. У донора Фреда началось кровотечение, а у Фреда началось перекрестное возбуждение, как показано на рисунке. Подробное описание того, как исправить у Фреда донорское кровотечение и принять перекрестное возбуждение, представлено в статье.

В приложении к этому видео теперь рассчитайте для каждого кластера TCR соотношение сигнала ошибки скорректированного изображения лада и соответствующего скорректированного образа донора лада. Определите скорректированный средний сигнал для доноров одиночных ладов и событий одиночных молекул и рассчитайте соотношение. Затем заполняемость TCR рассчитывается путем умножения обоих коэффициентов.

Теперь предел текучести ладов на графике определен для отдельных кластеров TCR в зависимости от их заполненности TCR. Затем C определяется с помощью линейной регрессии, как показано здесь. В Нашем примере это сводится ко второму раунду.

После просмотра этого видео вы сможете использовать белковый функционализированный липидный бислой в сочетании с флуоресцентной микроскопией одной молекулы для измерения кинетики синаптического связывания между PMHC и TCR. Были обсуждены все необходимые этапы, включая производство белка, мечение Т-клеток и окончательные измерения ладов. Кроме того, был подробно показан анализ изображений, дающий кривые активации Т-клеток и значения ладов.

Наконец, показана методология, лежащая в основе определения кинетических скоростей в выключенном состоянии. Аналогичный подход в принципе может быть использован для определения других взаимодействий лигандов синаптических рецепторов, хотя соответствующие модификации могут оказаться необходимыми.