Высокая пропускная способность Скрининг непокорности Вариации в лигноцеллюлозной биомассы: Total лигнина, лигнин мономеров и ферментативной сахара версии

Общая цель данной процедуры заключается в измерении устойчивости к термохимической предобработке и ферментативному гидролизу различных родственных вариантов биомассы. Это достигается путем предварительной подготовки образцов биомассы к тестированию посредством измельчения, сокращения размера частиц, а также экстракции крахмала и растворимых сахаров. На втором этапе биомасса с высокой точностью дозируется в высокопроизводительные реакторные планшеты, совместимые с термохимическим воздействием.

Образцы подвергают предварительной обработке в паровом реакторе. Затем образцы переваривают со стандартной коммерческой целлюлазой в течение трех дней для гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы. Заключительным этапом является определение глюкозы и ксилозы, высвобожденных в процессе ферментативного гидролиза, с помощью анализов GO pod и XDH.

В конечном итоге, высокопроизводительное количественное определение глюкозы и ксилозы используется для определения относительного выхода сахаров между образцами в расчете на грамм сахара на грамм исходной биомассы. Главное преимущество этого метода перед другими лабораторными способами, такими как предварительная обработка и ферментативный гидролиз в лабораторном масштабе, заключается в том, что данная методика позволяет одновременно обрабатывать сотни или даже тысячи образцов. Этот метод помогает ответить на ключевые вопросы в области переработки биомассы, например, какие культивары или варианты более пригодны для конверсии в сахара и последующие продукты.

Таким образом, применение данной методики может быть расширено для изучения структуры и функций клеточной стенки, поскольку мутации, создаваемые в пути биосинтеза клеточной стенки, могут быть проанализированы на предмет структурных химических изменений. Этот метод позволяет получить представление о резистентности клеточных стенок растений. Он также может быть применен к другим аспектам конверсии биомассы, таким как исследования ферментативной активности и синергизма.

Как правило, люди, которые только начинают осваивать этот метод, сталкиваются с трудностями, поскольку он предполагает работу с большими наборами образцов вариантов биомассы, которые необходимо обрабатывать идентично и одновременно в миллиграммовом масштабе. Таким образом, требуются специализированная робототехника и оборудование. Чтобы начать процедуру, перенесите примерно 250 мг предварительно измельченной биомассы из антистатического пакета со штрих-кодом в пронумерованный чайный пакетик; аккуратно сверните пакетик, убедившись, что края загнуты над биомассой, чтобы предотвратить ее потерю во время крахмалоудаления и экстракции. Затем закройте каждый чайный пакетик, обмотав его луженой медной проволокой, и запишите номер пакетика для каждого образца со штрих-кодом.

Добавьте 500 миллилитров предварительно приготовленного раствора фермента для удаления крахмала в пластиковый контейнер. Затем добавьте 120 чайных пакетиков в буферный раствор фермента для проведения протокола серийной обработки. После инкубации в шейкере промойте и замочите биомассу в нескольких литрах деионизированной воды на 30 минут после тщательной промывки биомассы, очищенной от крахмала.

Для удаления солей буфера поместите чайные пакетики в колонну Соклит для экстракции. Настройте обратный холодильник Соклит, используя 95% ethanol, и экстрагируйте образцы в течение 24 часов. По завершении экстракции разверните чайные пакетики и верните высушенную биомассу в исходные пробирки со штрих-кодами.

Антистатические пакеты. Перенесите не менее 50 миллиграммов высушенной биомассы в штифтовый бункер со штрих-кодом. Отсканируйте штрих-коды антистатических пакетов и принимающего бункера для обеспечения точного отслеживания образцов. После загрузки бункеров в робот для твердого взвешивания роботом отвесьте пять миллиграммов высушенных образцов в кислотостойкую нержавеющую сталь.

В 96-луночные планшеты отмеряют три повторности каждого образца, распределяя их по планшету таким образом, чтобы минимизировать любые локальные вариации. Затем в каждую лунку добавляют 250 µL деионизированной воды и герметизируют планшеты политетрафторэтиленовой лентой (PTFE) с силиконовым клеевым слоем. С помощью наконечника паяльника диаметром 1/8 дюйма в ленте PTFE делают отверстия в каждом порту для выхода пара.

Для каждой пластины плотно зажмите пластины с помощью стеклоармированных ПТФЭ-прокладок толщиной 0,031 дюйма, расположенных между пластинами, и пустых пластин сверху и снизу стопки. Проведите предварительную обработку образцов в паровом реакторе при температуре 180 °C в течение 17,5 минут. По завершении охладите пластины реактора до 50 °C, заполнив систему деионизированной водой.

После охлаждения планшетов центрифугируйте их в роторе с отклоняющимися стаканами. Центрифугирование проводите при 1700 GS в течение 20 минут. Затем снимите верхнюю пленку.

Добавьте по 40 µL предварительно приготовленного 8% стокового раствора фермента в каждую лунку. После повторного запечатывания новой тефлоновой лентой (PTFE) поместите запечатанную планшетку в магнитный зажим для планшетов. Осторожно перемешайте образцы путем инверсии не менее 15 раз и инкубируйте при 50 °C в течение 70 часов. После инкубации планшеты-реакторы перемешивают и центрифугируют.

Затем робот для работы с жидкостями используется для количественного определения глюкозы и ксилозы с помощью ферментативных колориметрических анализов: ксилозодегидрогеназы (XDH) для ксилозы и глюкозооксидазы с пероксидазой (go pod) для глюкозы. На платформе размещены резервуары с реагентами GO POD и XDH, а также вода для разведения и штативы с 96-канальными наконечниками объемом 200 µL для каждого реагента. Эти наконечники используются повторно для нескольких реакторных планшетов.

На платформе также находятся одноразовые наконечники объемом 200 µL для удаления воды и подготовки стандартного раствора сахара, а также заранее приготовленные стандарты сахара. Из карусели для хранения робот извлекает три прозрачных микротитрационных планшета: один для разведения смеси для гидролиза и по одному для анализов XDH и GoPod. Захват перемещает все четыре планшета в соответствующие позиции на платформе.

Одноразовые 96-канальные наконечники объемом 100 µL подаются на рабочую панель из карусели для переноса образцов из реактора в планшет для разведения, а затем из планшета для разведения в планшеты XDH и go pod. С помощью 8-канального дозатора с регулируемым объемом вода, добавленная перед предварительной обработкой, удаляется из трех лунок в каждом углу планшета реактора, чтобы предотвратить перенос в планшет для разведения. Эти 12 лунок используются для стандартов сахаров с применением 96-канального дозирующего блока.

После удаления трех наконечников из каждого угла в лунки планшета для разведения добавляют 180 µL воды. После замены наконечников реагенты XD, H и go pod переносят из соответствующих резервуаров в соответствующие аналитические планшеты, используя 96-канальную пипеточную головку.

В это время сахарные стандарты добавляют в три лунки в каждом углу планшета для разведений. После замены на наконечники меньшего размера с помощью восьмиканальной пипеточной головки в планшет для разведений переносят 20 µL супернатанта гидролиза, после чего планшет перемешивают. Образец следует набирать в верхней части жидкости, чтобы ограничить загрязнение наконечников частицами биомассы.

После перемешивания последовательно переносят 20 µL. С помощью 96-канального дозатора жидкость распределяют по планшетам XDH и go pod. После перемешивания каждой пробы триером наконечники возвращаются на стойку для отходов в карусели; планшеты XDH и go pod перемещают на отдельную стойку карусели и выдерживают в течение одного часа перед считыванием в спектрофотометре с использованием планшетного ридера для УФ-видимого диапазона на 96 лунок.

Установите измеряемую длину волны на 510 нанометров и зарегистрируйте оптическую плотность относительно холостой пробы реагента. После этого установите длину волны на планшетном ридере на 340 нанометров и зарегистрируйте оптическую плотность, используя небольшой шпатель. Перенесите примерно четыре миллиграмма подготовленной биомассы в стальную чашку объемом 80 мкл, предназначенную для автосамплера масс-спектрометра.

С помощью стандартного дырокола вручную изготовьте стеклянные фильтровальные диски из стекловолоконных листов типа ad без связующего вещества; с помощью пинцета поместите образцы в штативы автосамплера, загружая их в кюветы в случайном порядке, чтобы избежать систематической ошибки из-за дрейфа спектрометра с течением времени. После выполнения калибровки и ввода соответствующих параметров в масс-спектрометр начните сбор данных и подождите не менее 60 секунд для получения достаточного объема данных для регистрации фонового спектра. В завершение запустите автоматический метод автосамплера, используя поток газа-носителя гелия со скоростью 0.9 литров в минуту.

Примером таких тенденций является исследование устойчивости 755 природных вариантов тополя, отобранных на Тихоокеанском Северо-Западе. Результаты показывают, что при увеличении соотношения шприца к гильзе устойчивость снижается до достижения соотношения примерно два, после чего уровень улучшения устойчивости стабилизируется. Здесь можно увидеть отклонения, при которых ген PT four CL one был подавлен.

При screening сотни культиваров тополя было выявлено несколько образцов с явным повышением рекальцитрантности, о чем свидетельствует снижение высвобождения сахара. Различные сорта пшеничной соломы, выращенные на нескольких участках и собранные при различных условиях роста, позволили выделить 20 отдельных популяций на основе комбинаций вышеуказанных переменных. Эти наборы образцов легко дифференцируются и указывают на положительные и отрицательные переменные.

Для анализа пиролиза трудноразлагаемых веществ можно использовать масс-спектрометрию молекулярных пучков для оценки изменений в составе клеточной стенки. Масс-спектральные фрагменты соотносят с различными мономерами лигнина. При сравнении образца с высоким содержанием лигнина и образца с высоким содержанием углеводов различия в спектральных данных становятся очевидными.

Здесь продемонстрировано использование данных масс-спектрометрии в сочетании с методом анализа главных компонентов. График нагрузок главных компонентов может помочь определить, какие химические признаки объясняются на графике классификации счетов, а также выяснить, какие признаки изменяются между кластерами образцов. При правильном выполнении эта методика, после ее освоения, позволяет проводить скрининг тысяч образцов в неделю. При выполнении данной процедуры важно соблюдать максимальную последовательность и сравнивать только образцы из одного соответствующего набора.

Таким образом, после своей разработки этот метод открыл путь другим исследователям для работы над методами высокопроизводительного скрининга и другими областями изучения устойчивости клеточных стенок растений, используя такие средства, как ионные жидкости и щелочная предобработка. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как правильно подготавливать, обрабатывать и анализировать большие наборы образцов биомассы в микромасштабе для выявления различий в устойчивости с использованием измельчения и экстракции, термохимической предобработки и ферментативного гидролиза. Пожалуйста, помните, что работа с высоким давлением, паром и автоматизированным оборудованием чрезвычайно опасна и что следует соблюдать все меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты, а также использование защитных блокировок на всем оборудовании при выполнении этих процедур.