Идентификация редких бактериальными патогенами с 16S рРНК секвенирование гена и MALDI-TOF MS
11 июля 2016 г.
Matrix-assisted laser desorbtion/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) и молекулярные методы (секвенирование гена 16S рРНК) позволяют идентифицировать редкие бактериальные патогены в рутинной диагностике. Цель этого протокола заключается в сочетании обоих методов, что приводит к получению более точных и надежных данных.
Общая цель данного протокола масс-спектрометрии MALDI-TOF заключается в улучшении типирования редких патогенов с помощью быстрой и экономически эффективной процедуры. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области диагностической микробиологии, он позволяет оперативно выявлять редкие бактериальные патогены. Сегодня мы хотим поговорить об odoratimimus и бактериях рода Myroides.
Продемонстрировать метод и рассказать об интерпретации результатов. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут столкнуться с трудностями, поскольку перенос бактерий, наложение метрик и интерпретация результатов требуют технических навыков и микробиологических знаний. Впервые идея использовать MALD-TOF MS для скрининга редких бактерий пришла нам в голову, когда у нас в больнице был пациент, страдающий диабетической пищевой инфекцией, вызванной myroides odoratimus.
Начните этот протокол с экстракции бактериальной ДНК, ПЦР 16S рибосомальной ДНК и секвенирования по Сэнгеру, как описано в текстовом протоколе. Используйте деревянную зубочистку, чтобы перенести одну бактериальную колонию в лунку 96-луночной стальной мишени. Нанесите один микролитр 70% муравьиной кислоты на высушенный на воздухе организм на стальную мишень и оставьте сохнуть примерно на две-три минуты.
Нанесите на пятно один микролитр матричного раствора, содержащего 50 мг/мл CHCA в органическом растворителе, состоящем из 50% ацетонитрила, 2,5 трифторуксусной кислоты и 47,5% воды. Дайте мазку и наложенной матрице высохнуть на воздухе около пяти минут в вытяжке. Чтобы ввести образцы, проветривайте отверстие загрузки образцов масс-спектрометра, нажав кнопку впуска/выхода прибора.
Откройте загрузочное отверстие и вставьте целевую пластину MALDI-TOF MS с высушенным бактериальным мазком и матрицей. Закройте порт и снова эвакуируйтесь. Наблюдайте за вакуумом и когда он достигнет 4,5 миллионов миллибар, начните измерение.
Откройте программу для анализа MMIS и щелкните меню «Файл». Выберите "Новая классификация", и должно открыться новое окно под названием "MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard". Введите название проекта в поле «Название проекта» и нажмите «Создать», под новым диалоговым окном под названием «Новый проект», проверьте название проекта и продолжите, нажав кнопку «ОК».
В мастере классификации в реальном времени MALDI Biotyper обратите внимание на окно размещения аналита. Выберите целевые позиции, щелкните правой кнопкой мыши любую выбранную позицию и выберите Добавить сэмплы. В автоматически открывшемся табличном представлении введите имя примера, идентификатор образца и, при необходимости, комментарий.
Нажмите кнопку «Далее», чтобы продолжить. Далее обратите внимание на выбор окна методов MALDI Biotyper. Выберите Bruker Taxonomy" из MSP из Taxonomy Trees и нажмите Next", чтобы продолжить.
Затем обратите внимание на окно сводки проекта. Проверьте вставленные записи, приведенные выше, для фактического проекта классификации. Запустите прогон классификации, нажав кнопку Готово.
Измерения начинаются автоматически при достижении соответствующего вакуума. Выполняйте классификацию до тех пор, пока измерение не будет успешно завершено. После завершения измерения откройте меню «Вид» и нажмите «Результаты», чтобы просмотреть таблицу результатов в проекте MALDI Biotyper Real Time Classification Project One.
Просмотрите результаты классификации Bruker-Daltonik MALDI Biotyper в виде html-файла в веб-браузере по умолчанию. Распечатайте и сохраните результаты. Здесь представлены спектры, полученные с помощью MALDI-TOF MS, которые измеряются и классифицируются в режиме реального времени.
Спектрам присваивается видовое название и значение балла, отражающее качество измерения. Баллы выше 2,300 представляют собой высоковероятную идентификацию вида. Оценка от 2,000 до 2,300 указывает на безопасную идентификацию вида.
Оценка ниже 1,700 и 2,000 указывает на вероятную идентификацию вида. А оценка ниже 1,700 ненадежна. Идентификация бактериальных возбудителей, выращенных на чистой культуре на твердой среде, занимает две-три минуты.
Важно помнить, что возбудители редких бактерий могут быть обнаружены с помощью MALDI-TOF MS только в том случае, если прибор надежно содержит соответствующие спектры. В противном случае он должен быть удален путем интеграции спектров MaSDA из типированных штаммов их охарактеризованных изолятов. В случае, когда результаты оценки не приводят к однозначной идентификации штамма, могут быть применены дополнительные методы, такие как биохимическое профилирование или секвенирование 16S рДНК.
Хотя этот метод может дать представление об обнаружении бактерий, он также может быть применен к другим микроорганизмам, таким как грибки или анаэробы. Кроме того, можно измерить устойчивость к бактериям. Не забывайте работать с матрицей, которая является опасным веществом, надевайте перчатки, защитные очки и работайте под капотом.
Кроме того, абсолютно необходимо высушить матрицу и тщательно размазать, чтобы избежать разбрызгивания в камере анализа.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается применение масс-спектрометрии MALDI-TOF для улучшения идентификации редких бактериальных патогенов. Интегрируя этот метод с молекулярными техниками, исследователи могут достичь более точной диагностики в микробиологии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Диагностические методы
- Идентификация патогенов
Теоретические основы
- MALDI-TOF MS является мощным инструментом для типирования патогенов.
- Редкие бактериальные патогены создают сложности при рутинной диагностике.
- Понимание ограничений традиционных методов имеет решающее значение.
- Для эффективного внедрения требуются соответствующие технические навыки.
Цель исследования
- Улучшить типирование редких патогенов.
- Обеспечить быструю и экономически эффективную диагностическую процедуру.
- Продемонстрировать метод на конкретных примерах бактерий.
Используемые методы
- Масс-спектрометрия MALDI-TOF для скрининга патогенов.
- Секвенирование гена 16S rRNA для молекулярной идентификации.
- Технические процедуры переноса и посева бактерий поверхностным методом.
- Интерпретация результатов масс-спектрометрии.
Основные результаты
- Успешная идентификация Myroides odoratimimus.
- Демонстрация возможности экспресс-диагностики редких патогенов.
- Подчеркнута важность технической экспертизы.
- Представлены данные о применимости метода в клинических условиях.
Выводы
- Сочетание MALDI-TOF MS с молекулярными методами повышает эффективность диагностики.
- Для эффективного применения данного метода необходимо соответствующее обучение.
- Будущие разработки могут расширить возможности идентификации патогенов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Точная идентификация редких бактериальных патогенов имеет решающее значение для диагностической микробиологии в биофармацевтических исследованиях и разработках (R&D), особенно для групп пациентов с иммунодефицитом. Интеграция MALDI-TOF MS с секвенированием 16S рРНК обеспечивает быструю и экономически эффективную идентификацию на уровне вида, что способствует снижению механистических рисков при валидации мишеней антимикробных препаратов. Данный комбинированный подход повышает прогностическую достоверность в доклинических моделях за счет сокращения количества ложноотрицательных результатов при обнаружении патогенов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем подтверждения идентичности редких патогенов в моделях инфекции.
- Практическая ценность: обеспечивает надежную идентификацию штаммов в соответствии с номенклатурой, что необходимо для воспроизводимого снижения рисков при разработке мишеней.
- Прогностическая ценность: способствует сортировке портфеля проектов за счет точной характеристики патогенов в системах, релевантных для заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает получение количественных показателей (например, >2.300 для высокой вероятности идентификации), что позволяет стандартизировать подтверждение попаданий при антимикробном скрининге.
- Операционная ценность: облегчает подготовку анализа за счет быстрой (<3 мин) идентификации чистой культуры, что повышает пропускную способность и масштабируемость скрининга.
- Ценность воспроизводимости: обеспечивает сопоставимость результатов между различными лабораториями благодаря стандартизированному сопоставлению спектров и использованию валидированных баз данных.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает переход от этапа открытия к доклиническим исследованиям путем валидации редких патогенов в клинически значимых моделях инфекций.
- Практическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков, когда пороговые значения показателей (2.000–2.300) подтверждают достоверную идентификацию вида.
- Трансляционная преемственность: способствует согласованию биомаркеров в случаях, когда присутствие патогена коррелирует с ответом организма хозяина в моделях с иммунодефицитом.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в процесс разработки, охватывающий путь от валидации мишени до доклинической оценки, где точная идентификация патогена служит основой для изучения механизмов действия и оценки перспективных соединений.
- Открывающая биология: Поддерживает проверку гипотез путем подтверждения присутствия редких бактериальных агентов в моделях инфекции, что снижает неопределенность механизмов.
- Скрининг: Обеспечивает готовые к анализу валидированные биологические системы с количественными результатами для надежной оценки соединений.
- Аналитика: Предоставляет основанные на баллах результаты считывания (например, классификацию MALDI Biotyper), которые позволяют объективно сравнивать условия и проводить валидацию хитов.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преклиническую преемственность за счет валидации патогенов в системах, имеющих отношение к заболеванию, при наличии подтверждающих исходных материалов.
- Корпоративное повторное использование: Служит многократно используемым диагностическим инструментом в нескольких проектах по изучению редких патогенов, сокращая затраты на повторную валидацию.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической уверенности в валидации мишеней, сокращение числа ошибочных определений патогенов и снижение механистических рисков.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость идентификации патогенов в различных лабораториях.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении антимикробных программ, эффективность использования капитала за счет экспресс-диагностики и снижение биологических рисков на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Приоритизация антимикробных кандидатов на основе рисков с использованием подтвержденной идентификации патогенов в доклинических моделях.
Особенности реализации
- Требуются микробиологические навыки для переноса бактерий, нанесения матрицы и интерпретации результатов.
- Метод зависит от наличия оборудования MALDI-TOF MS с обновленными таксономическими базами данных (например, Bruker Taxonomy) для точного сопоставления спектров.
- Необходимы стандартизированные протоколы подготовки образцов для обеспечения высыхания матрицы и мазка, чтобы предотвратить загрязнение анализатора.
- При получении показателей MALDI-TOF ниже 1.700, что указывает на недостоверную идентификацию, требуется переход к секвенированию 16S rRNA или биохимическому профилированию.
- Процедура включает протоколы безопасности при работе с опасными растворами матриц (например, муравьиной кислотой, ацетонитрилом) в вытяжном шкафу с использованием СИЗ.
