Экстракорпоральное поколение мышиный плазмоцитов дендритных клеток из общего предшественники лимфоидных клеток с использованием Feeder System АС-6

Общая цель данной процедуры заключается в предоставлении эффективного метода получения плазмоцитоидных дендритных клеток или PDCs для изучения их развития. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, такие как: каким образом регулируется развитие PDCs? Основным преимуществом данной методики является возможность использования небольшого количества клеток-предшественников для эффективного получения большого количества PDCs.

Значение данной методики заключается в её применении для терапии аутоиммунных заболеваний, связанных с PDC, таких как системная красная волчанка, атетоз и псориаз. Демонстрация данной процедуры сегодня будет проведена отличным студентом лаборатории. За день до сбора клеток костного мозга посейте клетки стромальной линии AC6 в плотности 5,9 × 10⁴ клеток на лунку в отдельные лунки 12-луночных планшетов и инкубируйте планшеты при 37 °C и 5% CO₂ в течение ночи. На следующее утро облучите клетки AC6 гамма-излучением в дозе 3000 рад и замените культуральную среду на 1 мл полной среды.

Затем поместите необходимое количество взрослых мышей дикого типа C 57 black six в препаровальную ванночку и стерилизуйте животных 70% ethanol. Перенесите ванночку в полустерильный ламинарный бокс и сделайте надрезы в средней части брюшной полости каждого животного, удалив кожу с дистальных отделов, включая нижние конечности, чтобы освободить бедренные и большеберцовые кости; перережьте бедренную кость выше, а большеберцовую — ниже коленных суставов и с помощью ножниц отделяйте мышцы от костей по мере их извлечения. Поместите кости в чашку Петри диаметром 6 cm, содержащую 5 mL полного RPMI, и перенесите чашку Петри в стерильный бокс для культивирования.

Теперь наполните трехмиллилитровый шприц, оснащенный иглой 27-го калибра, полной средой RPMI и с помощью ножниц обрежьте оба конца каждой кости. Введите иглу в каждую кость и вымойте костный мозг, аккуратно впрыснув полную среду RPMI по одному разу с каждого конца. Затем, сняв иглу, осторожно аспирируйте и вылейте клетки в чашку для культивирования от трех до пяти раз, чтобы получить суспензию одиночных клеток.

После центрифугирования клеток проведите лизис эритроцитов, добавив 1 мл буфера CK, и остановите реакцию, добавив 10 объемов полной среды RPMI. Через одну минуту дайте скоплениям погибших клеток и детриту осесть в течение пяти минут, затем осторожно перелейте супернатант в новую пробирку. После повторного центрифугирования клеток суспендируйте все клетки костного мозга в 100 µL буфера FACS для анализа общих лимфоидных предшественников (CLP) методом проточной цитометрии.

Затем проведите блокировку Fc-рецепторов клеток с помощью антител к CD16/32 в течение одной-двух минут, после чего приступайте к одновременному окрашиванию клеток соответствующим коктейлем антител. После выдержки на льду в течение 15 минут промойте клетки тремя миллилитрами буфера FACS и ресуспендируйте осадок в 300 µL свежего буфера FACS. Затем профильтруйте клеточную суспензию через стрейнер с ячейками 40 µm и немедленно проведите сортировку клеток на проточном цитометре, используя соответствующие фильтры и значения напряжения.

Сбор интересующих клеток в пробирку объемом 15 мл, содержащую 8 мл полной среды RPMI. Для получения высокообогащенной популяции PDCM крайне важно отсортировать подходящую популяцию CLP из полученного костного мозга для их последуго культивирования in vitro с использованием фидерной системы Z6. По завершении сортировки центрифугируйте клетки и ресуспендируйте осадок клеток CLP достаточным количеством полной среды RPMI, чтобы получить плотность клеток около 5 × 10⁴ клеток/мл.

Затем высейте по 500 клеток в каждую лунку 12-луночного планшета, содержащего фидерные клетки AC six, и дополните кокультуры 100 ng/mL лиганда FL three; после этого инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2, периодически контролируя развитие дендритных клеток (DC) под микроскопом. На 12-й день соберите клетки из супернатанта кокультуры и один раз промойте каждую лунку 0,5 mL полной среды RPMI, объединив полученный супернатант и промывочные растворы. Затем добавьте по 0,5 mL свежей среды в каждую лунку и с помощью скребка для клеток отделите адгезивные клетки.

Объедините отделившиеся клетки с плавающими клетками и центрифугируйте полученную клеточную суспензию. Ресуспендируйте осадок в 50 µL буфера FACS. Затем подсчитайте количество клеток и, после Fc-блокировки, окрасьте их на экспрессию CD11c, CD11b и B220.

Как было только что продемонстрировано, клетки совместного культивирования затем можно проанализировать на наличие популяций дендритных клеток: обычных CD11c-положительных, CD11b-положительных, B220-отрицательных и плазмоцитоидных CD11c-положительных, CD11b-отрицательных, B220-положительных, при общем количестве от 4 до 6 × 10⁷ клеток костного мозга. Клетки костного мозга обычно выделяют из бедренных и большеберцовых костей мышей дикого типа C57BL/6 в возрасте от 6 до 8 недель, при этом 5 × 10⁴ CLP обычно получают от одной мыши C57BL/6. После сортировки методом проточной цитометрии, как было показано выше, к 3–4 дню совместного культивирования с фидерными клетками AC6 начинают появляться клетки, формирующие «булыжную мостовую» (cobblestone area forming cells), при этом округлые плазмоцитоидные DC обнаруживаются в виде суспензии над клетками, формирующими «булыжную мостовую».

К восьмому дню количество плазмоцитоидных дендритных клеток (DC) достигает пика примерно к 12–14 дням, после чего клетки начинают подвергаться апоптозу вслед за завершением их полного развития, и их число постепенно снижается. Колонии обычных DC появляются позже, на шестой-восьмой день; они являются адгезивными и имеют более крупную веретеновидную морфологию. Анализ методом проточной цитометрии показывает, что в кокультурах содержится 91% CD11c-положительных, CD11b-отрицательных, B220-положительных плазмоцитоидных DC и 6% CD11c-положительных, CD11b-положительных, B220-отрицательных обычных DC, что свидетельствует о стократном увеличении количества плазмоцитоидных DC по сравнению с исходной популяцией CLP при использовании данного метода.

При выполнении данной процедуры важно убедиться, что клетка C6 находится в хорошем состоянии, а плотность C правильная перед добавлением CLP после развития. Этот метод позволил исследователям в области биологии DC преодолеть ограничение, связанное с использованием небольшого количества проекторов для изучения развития DC из различных проекторов. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как генерировать PC in vitro из CLP с использованием системы C6 BEAT.