Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки из человеческой периферической Т-клеток с использованием вируса Сендай в фидерной бесплатно условиях

Общей целью этой процедуры является получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или ИПК из периферических Т-клеток человека в условиях отсутствия фидеров. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенеративной медицины, в том числе на то, как IPS-клетки могут быть применены в клинической практике. Основное преимущество данной методики заключается в том, что IPS-клетки можно вылечить без включения возможного рефакторинга вреда, что снижает риск патогенности.

Применение этого метода расширяет мировые клинически значимые методы лечения на основе IPS-клеток, поскольку этот инвазивный отбор образцов клеток в сочетании со снижением риска подверженности разрабатываемых IPS-клеток воздействию неопределенных патогенов. Таким образом, этот метод может дать представление о клинической терапии IPS. Он также может быть применен в других областях, таких как моделирование заболеваний.

Начните подготовку активированных Т-клеток человека, разбавив 10 миллилитров гепаринизированной цельной крови с 10 миллилитрами пипетки DPBS. 15 миллилитров раствора фола в 50-миллилитровую коническую пробирку. Медленно пипеткой разбавленную кровь, стекающую по внутренней стенке пробирки, выложите сверху раствор.

Будьте осторожны, чтобы не нарушить работу интерфейса. Центрифугируйте пробирку при 400 умноженных на G в течение 30 минут при комнатной температуре. После центрифугирования наблюдайте за тремя слоями, включая нижний прозрачный слой, тонкий белый слой, содержащий мононуклеарные клетки, и верхний слой молочной плазмы.

Перенесите слой мононуклеарной ячейки в новую коническую трубку объемом 50 миллилитров без переноса раствора для подходящего отверстия. Далее добавьте DPBS, чтобы довести общий объем до 10 миллилитров. Центрифугируйте пробирку при 200-кратном G в течение пяти минут при комнатной температуре.

Выбросьте надосадочную жидкость, промойте клетки 10 миллилитрами DPBS, центрифугируйте пробирку при 200-кратном G в течение пяти минут и удалите надосадочную жидкость. Затем добавьте к клеткам один миллилитр среды KBM 5 0 2 и подсчитайте с помощью гемоцитометра для приготовления чашки для клеточной культуры, покройте лунки шестилуночного планшета 10 микрограммами на миллилитр раствора античеловеческого CD трех антител в PBS. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа не менее 30 минут.

После инкубации удалить раствор антитела из восьмерки и промыть один раз с затравкой PBS мононуклеарные клетки с плотностью от 2,5 до 10 до пятой клетки на квадратный сантиметр в общем объеме двух миллилитров среды KBM 5 0 2 в покрытых покрытием шести лунках инкубировать клетки в течение трех-семи дней без смены среды, в этот момент Т-клетка должна достичь контективности через три-семь дней. Перенесите активированные Т-клетки со средой в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при температуре 200 G в течение пяти минут. Выньте SNAT и добавьте один миллилитр свежего KBM 5 0 2 medium.

Подсчитайте клетки и пластину от 1,5 умножить на 10 к шести клеткам в двух миллилитрах KBM 5 0 2 среды в каждую лунку с покрытием из трех антител, покрытых шестилуночным планшетом, затем разморозить OC три раствора вируса SOX два, KLF четыре и C-M-Y-C-H и L sendi на льду в каждой сконструированной вирусе Сендай индивидуально в каждую лунку и кратность инфекции 10. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов. Затем соберите зараженные клетки с помощью пипетки и перенесите их в коническую пробирку объемом 15 миллилитров

Центрифугируйте клетки при 200-кратном G в течение пяти минут. Снимите надосадочную жидкость и добавьте два миллилитра свежей KBM 5 0 2 средних. Замените клетки в лунках шестилуночного планшета и инкубируйте в течение 24 часов в инкубаторе для клеточных культур.

Чтобы отступить клетки, сначала разморозьте матричный раствор базальной мембраны при четырех градусах Цельсия за ночь, растворите 0,2 миллилитра мысленного раствора в 10 миллилитрах средней пластины DMM F 12, пять миллилитров матричного раствора базальной мембраны в 100-миллиметровой посуде. Оставьте пластины при комнатной температуре не менее чем на 30 минут, чтобы матрица покрыла чашку перед засевом ячеек. Тем временем соберите зараженные вирусом SAI Т-клетки в 15-литровую коническую пробирку и центрифугируйте при температуре 200 G в течение пяти минут.

Затем повторно суспендируйте нёбо в одном миллилитре свежей среды KBM 5 0 2 и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра после 30-минутного инкубационного периода. Удалите матричный раствор базальной мембраны из двух планшетов, затем ресуспендируйте один раз по 10 до пятой клетки и отдельно один раз по 10 к шести клеткам в 10 миллилитров свежей среды M-T-E-S-R, питательной бесклеточной питательной среды для ipsc. Пипеткой поместите каждую клеточную суспензию на отдельную 100-миллиметровую пластину.

Инкубируйте планшет в инкубаторе для клеточных культур. Смена среды через день через 20 – 30 дней. Должны появиться колонии, напоминающие колонии эмбриональных стволовых клеток.

Подготовьте шесть настенных пластин для расширения IPSC, инкубируя по одному миллилитру раствора матрицы базальной мембраны в каждой лунке в течение 30 минут при комнатной температуре. Тем временем просмотрите планшеты, содержащие колонии IPSC, под стереомикроскопом и изолируйте отдельные колонии, соскоблив их с помощью пипетки объемом 20 микролитров. Переложите каждую колонию в лунку и настенную пластину 96, содержащую 20 микролитров среды M-T-E-S-R.

После переноса колоний добавьте 200 микролитров среды M-T-E-S-R в каждую лунку и пипетируйте вверх и вниз, чтобы нарушить колонию. После удаления матричного раствора базальной мембраны из шести луночных планшетов переносят клетки из отдельной колонии в каждую лунку, затем добавляют два миллилитра среды M-T-E-S-R, инкубируют клетки в инкубаторе для клеточных культур и меняют среду через день с использованием питательной культуры без культуры и сыворотки без среды. Иммунофлуоресцентное окрашивание выявило экспрессию типичных плюрипотентных клеточных маркеров, в том числе nano T three four SSEA four, TRA one 60 и TRA 180 1.

В этих производных линиях IPSE. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о выполнении всех шагов, учитывая все важные соображения стерильности и биобезопасности.