Количественное толстой стволовых клеток мутации

Общая цель этой процедуры заключается в количественной оценке фенотипических соматических мутаций в гене глюкозо-шестифосфатдегидрогеназы или гена G 6-фосфат-дегидрогеназы в стволовых клетках толстой кишки. После обработки животных предполагаемыми генотоксическими агентами это достигается путем первичной обработки животных агентом, выжидающим достаточное количество времени, чтобы потомство стволовой клетки, несущей мутацию G 6 PD, полностью заселило крипту, жертвоприношением животного, удалением толстой кишки и формированием из нее швейцарского рулона и замораживанием ткани в жидком азоте. Второй шаг заключается в подготовке замороженных срезов толщиной семь микрон на предметных стеклах из толстой кишки с помощью криостата.

Ткань нагревают до 37 градусов Цельсия, а затем вокруг участков ткани сооружаются лунки для окрашивания ткани. Заключительным этапом является инкубация срезов тканей с окрашивающей смесью G six PD, а затем анализ срезов под световым микроскопом клеток с активностью G six PD окрашивается в синий цвет, в то время как клетки с фенотипическими мутациями выглядят беловатыми. В конечном счете, количественная оценка мутировавших crips используется для определения частоты мутаций.

Этот метод измеряет соматические мутации глюкозо-шестифосфатдегидрогеназы в стволовых клетках, и это критическая популяция клеток в канцерогенезе толстой кишки. Выявляя мутации соматических стволовых клеток, можно соотнести частоту мутаций со случаями рака толстой кишки у животных, получавших лечение. Хотя этот метод может дать представление о мутациях стволовых клеток в толстой кишке, он также может быть применен к другим модельным организмам или системам органов.

Если удастся определить нишу стволовых клеток, то, как правило, люди, не знакомые с этим методом, будут испытывать трудности с приготовлением раствора MBT. Растворяющее. Решение MBT требует тщательного подхода к подробным инструкциям. Для начала приготовления гистологического окрашивающего раствора при рН 7,4 фосфатного буфера до 35 мл оптимальной температуры резки или ОКТ-среды в 50-миллилитровой пробирке и энергично встряхните до однородности, используя рН-бумагу.

Подтверждено, что раствор имеет pH примерно 7,4. Далее на глюкозе шесть фосфатов и раствор ДП и хлорида магния растворили в фосфатном буфере, как указано в текстовом протоколе и снова подтвердили, что рН раствора остается примерно 7,4. Добавьте раствор M-M-P-M-S и энергично перемешайте.

В результате раствор должен стать прозрачным, темно-красным гомогенатом, чтобы свести к минимуму воздействие света. Если раствор помутнел, его следует выбросить, пока нагревается масляная баня. Отдельно приготовьте пятимиллимолярный нитро синий до тераза олеума или раствор ОБТ, смешав 0,4 миллилитра диметилформамида, 0,4 миллилитров безводного этанола и ОБТ в двухмиллилитровой тубе с уплотнительным кольцом, неплотно закупорьте трубку и доведите ее до кипения в масляной бане до полного растворения ОБТ.

Далее дайте раствору MBT остыть до комнатной температуры, а затем добавьте его в реакционную смесь OCT. Со временем раствор может менять цвет с исходного оранжево-красного на темно-красный или фиолетовый. После обработки животных и подготовки замороженных срезов, как указано в текстовом протоколе, соорудите лунки для окрашивания тканей с помощью двух стальных шайб, склеенных между собой силиконовой смазкой, подогните парфюм к основанию шайбы и вырежьте центр, куда будет помещен раствор на замену.

До войны замороженная ткань скользит во влажной комнате с температурой 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Затем поместите лунки на предметное стекло, чтобы окружить участки тканей примерно половиной миллилитра ранее приготовленной смеси для окрашивания G six PD на каждый участок ткани и инкубируйте в течение 45-50 минут. Уберите горки из теплого помещения и осторожно снимите с них лунки из нержавеющей стали.

Поместите предметные стекла на длинную кромку и слейте воду из смеси реакционной смеси, после чего промойте от 30 до 60 минут и добавьте 100 миллимолярных фосфатных буферов. Чтобы удалить последние следы окрашивающего раствора G six PD, промойте предметные стекла и деионизируйте воду в течение 5-10 минут, чтобы удалить остаточный фосфатный буфер. Наконец, запечатайте ткань, добавив флюорогель по каплям на предметное стекло, и высушите в течение 30 минут, чтобы получить изображения для последующего анализа.

Поместите предметное стекло на световой микроскоп и отрегулируйте увеличение до четырех DX. Затем сфотографируйте участок окрашенной ткани с помощью камеры с разрешением 5,0 мегапикселей, чтобы оценить общее количество исследованных склепов. Для каждой мыши выберите участок с наименьшей площадью поверхности и сделайте его изображение с 10-кратным увеличением.

Посчитайте количество мутантных крипов. Согласно следующим критериям, весь склеп лишен синего цвета. Внешняя структура крипты не повреждена.

Мутант наблюдается на соседних семимикронных срезах, и два наблюдателя идентифицируют один и тот же склеп как мутанта. Визуально посчитайте количество склепов в этом разделе и умножьте на количество экранированных уровней для каждого двоеточия. Примеры мутантных Crips, наблюдаемых у мышей, обработанных агентом, повреждающим ДНК, азоксиметаном, можно увидеть здесь, слева, вы видите вертикальный или нисходящий вид мутантного крипты.

В то время как справа находится горизонтальный или боковой вид, для того, чтобы склеп был объявлен мутантным, все клетки внутри склепа должны остаться. Белые крипты с небольшим количеством белого появляются из-за выработки слизи из бокаловидных клеток. Частота мутаций рассчитывается как деление числа наблюдаемых мутантов на общее количество крипт, в которых не было обнаружено ни одного мутанта.

Crips наблюдались в толстой кишке у контрольных мышей, представляя частоту мутаций менее одного умноженного на 10 до минус пятого, в то время как у мышей, получавших азоксиметан, частота мутации стволовых клеток составила 4,44 раза по 10 до минус четырех. Другие методы, такие как генетический анализ типа мутаций глюкозы x фосфатдегидрогеназы, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как химический агент неправильно кодирует мутацию. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как измерять мутации соматических стволовых клеток у мышей, получавших потенциальные мутагенные и канцерогенные соединения.