Сотовый Сортировка нейронных стволовых и прогениторных клеток из взрослых мышей субвентрикулярной зоны и Live-визуализация клеточного цикла динамика

Общая цель данной процедуры заключается в отслеживании прогрессии клеточного цикла отсортированных нейральных стволовых клеток и их потомства, выделенных из субвентрикулярной зоны трансгенных мышей линии FUCCI (fluorescence ubiquitination cell cycle indicator). Это достигается путем первоначального препарирования субвентрикулярной зоны головного мозга взрослых трансгенных мышей. На втором этапе осуществляется диссоциация нейрональной ткани в суспензию из отдельных клеток с использованием папаина.

Затем различные популяции нейрогенных клеток субвентрикулярной зоны маркируются с помощью антител для идентификации покоящихся нейральных стволовых клеток, активированных нейральных стволовых клеток, транзиторно усиливающихся клеток, а также незрелых и мигрирующих нейробластов. На заключительном этапе используется FACS для прямого сортирования клеток в свежую культуральную среду перед их высевом на планшеты, покрытые поли-D-лизином. В конечном итоге применяется непрерывная видеомикроскопия в режиме тайм-лапс для изучения прогрессии клеточного цикла высеянных клеток, поскольку различные трансгенные клетки флуоресцируют в разные моменты своего клеточного цикла.

Сочетание метода сортировки клеток с технологией Fuji позволяет визуализировать и изолировать различные популяции клеток из субвентрикулярной зоны, что дает возможность изучать их свойства и динамику в мозге взрослого организма. Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в контексте старения и патологий головного мозга. За день до проведения эксперимента в каждую лунку стерильного 96-луночного планшета с черными стенками добавьте около 200 µL раствора поли-D-лизина в концентрации 10 µg/mL для покрытия дна лунок; накройте планшет и инкубируйте его в течение ночи при 37 °C. На следующий день.

Удалите раствор поли-D-лизина и трижды промойте лунки стерильной дистиллированной водой, после чего дайте планшету высохнуть в вытяжном шкафу при ламинарном потоке воздуха в течение не менее двух часов. Если планшет не используется сразу, храните высушенный планшет с покрытием при температуре 4 °C не более семи дней.

Затем приготовьте раствор папаина для диссоциации и стерилизуйте его, пропустив смесь через фильтр с порами 0,2 мкм. Перед использованием предварительно нагрейте раствор до 37 °C. Также приготовьте раствор ингибитора протеаз, добавив 0,7 мг/мл трипсина в ингибиторе типа два в стерильную среду TM F 12.

Профильтруйте раствор через фильтр с порами 0,2 мкм и предварительно нагрейте его до 37 °C перед использованием. Поместите свежепрепарированную субвентрикулярную зону мозга взрослой мыши линии fucci red в чашку Петри с 0,6% Glucose в PBS и измельчите ткань до полного исчезновения крупных фрагментов. Затем перенесите всё содержимое в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 200 ×g в течение пяти минут.

После центрифугирования ткани слейте супернатант. Ресуспендируйте ткань в одном миллилитре предварительно подогретого папаина, дополненного 0.01 mg/mL DNase I. Инкубируйте смесь в течение 10 минут на водяной бане при 37 °C.

Затем снова центрифугируйте при 200 ×g в течение пяти минут и удалите супернатант. Добавьте 1 mL предварительно нагретого раствора OVO MOID, чтобы остановить ферментативное переваривание. Далее, используя наконечник микропипетки P 1000, осторожно произведите 20 циклов перемешивания (всасывания и вытеснения), чтобы механически диссоциировать измельченную ткань в суспензию из единичных клеток.

Избегайте появления пузырьков воздуха в смеси, так как это может вызвать дополнительный стресс для клеток. Пропустите клеточную суспензию через стерильный фильтр с размером пор 20 micron в новую пробирку объемом 15 milliliter. Промойте фильтр двумя миллилитрами PBS, содержащего 0.15%BSA, чтобы избежать потери клеток.

Затем центрифугируйте суспензию клеток при 200 ×g в течение 10 минут. Удалите супернатант. Выполните окрашивание, предварительно суспендировав клетки каждого мыша в 100 µL PBS, содержащего 0.15% BSA.

Используйте одну десятую часть клеток одной из мышей для подготовки каждого из четырех контролей, как описано в прилагаемом текстовом протоколе. Добавьте перечисленные здесь первичные антитела в каждую из пробирок, используемых для сортировки клеток, и инкубируйте смеси в течение 20 минут в темноте при температуре 4 °C. После инкубации с первичными антителами промойте клетки одним миллилитром PBS, содержащего 0.15%BS, A, а затем центрифугируйте клетки при 200 ×g в течение 10 минут.

Резуспендируйте клетки в 200 µL PBS, содержащего 0.15% BSA, в расчете на один мозг, и перенесите их в подходящие пробирки для сортировки. Поместите пробирки для сортировки клеток на лед и непосредственно перед началом сортировки добавьте к клеткам краситель для определения жизнеспособности, например, Hoechst 33342 в концентрации 2 µg/mL, чтобы отличить живые клетки от мертвых.

Затем проанализируйте клетки из пробирки с отрицательным контролем на проточном цитометре и выделите популяцию клеток, используя параметры бокового и прямого светорассеяния. Исключите погибшие клетки, установив гейт только на негативную фракцию, и дуплеты, отбирая импульсы с негативной фракцией. Проведите анализ одноцветных контролей и при необходимости отрегулируйте напряжение на фотоэлектронных умножителях.

Выполните цветокоррекцию в окне компенсации программного обеспечения. Проанализируйте три контрольных образца с одним выключенным флуорохромом (fluorescence minus one) и установите гейты для сортировки. После настройки всех гейтов отсортируйте меченые клетки непосредственно в 100 µL среды для культивирования.

Высейте свежесортированные клетки с плотностью от 1000 до 3000 клеток на лунку на 96-луночные планшеты, покрытые поли-D-лизином, в 300 µL культуральной среды. Инкубируйте планшеты с культурами при 37 °C и 5% CO2 в течение как минимум одного часа.

Для обеспечения адгезии клеток подготовьте конфокальный лазерный сканирующий микроскоп для визуализации, предварительно нагрев встроенную термостатируемую камеру до 37 °C в атмосфере 5% carbon dioxide. Поместите 96-луночный планшет в предварительно прогретую камеру микроскопа и сфокусируйте первую лунку. Затем откройте программное обеспечение для визуализации и щелкните правой кнопкой мыши в главном окне, чтобы выбрать acquire acquisition controls и DEAC acquisition.

Чтобы открыть панель TI и затем выбрать объектив plan A PO VC 20 XDIC, нажмите на элементы управления сбором данных (acquire acquisition controls), а затем откройте параметры таймлапса (time-lapse options). Установите центр каждой лунки в качестве позиции предметного столика и выберите параметр размера изображения «7x7 mm²». Просмотрите мозаичное изображение вокруг центра каждой лунки.

Установите перекрытие для большого мозаичного изображения на 5% и задайте частоту так, чтобы снимки делались каждые 20 минут в течение 24 часов. В настройках «one plus» выберите уровень напряжения фотоэлектронного умножителя для каждого канала флуоресценции, указанного в строке меню. Выберите режим получения изображений с помощью высокоскоростного резонансного сканера в формате 512 x 512 пикселей и используйте DIC для визуализации клеток.

Затем выберите папку для сохранения файлов с данными. Нажмите кнопку run now в окне сбора данных ND, чтобы начать процесс сбора. Проследите за работой компьютера на протяжении как минимум одного цикла, чтобы убедиться в правильности функционирования всех систем.

Для отслеживания фазы G1 с помощью красной флуоресценции методом таймлапс-видеомикроскопии использовали мышей линии Fuji red. Изолированные клетки проявляют красную флуоресценцию во время первой фазы роста и теряют её во время синтеза, второй фазы роста и митоза. Lex-положительные eeg FR-положительные и eeg.

FR-положительные клетки молодых взрослых и мышей среднего возраста высевали и отслеживали с помощью микроскопии. Продолжительность S- и G2/M-фаз не различалась между Lex-положительными EGFR-положительными и EGFR-положительными клетками как у молодых, так и у мышей среднего возраста. Однако было обнаружено, что продолжительность следующей фазы роста от первого деления до прекращения красной флуоресценции была больше в более старых клетках из-за увеличения продолжительности G1-фазы.

Нейросферы, полученные через пять дней после посева, имеют меньший размер в Lex-положительных EGFR-положительных клетках, выделенных из более старых мышей. Весь протокол при работе с 12 мышами не должен занимать более трех часов на препарирование и подготовку суспензии и еще трех часов на сортировку клеток. Имейте в виду, что работа со слишком большим количеством мышей в один день приведет к увеличению продолжительности сортировки клеток, что может привести к повышению уровня гибели или дифференцировки клеток.