Оптимизированная метод выделения и расширение Инвариантные естественных киллеров Т-клеток из селезенки мыши

Общая цель этой процедуры заключается в расширении вариантов естественных киллеров T или INKT клеток, собранных из селезенки мыши. Это достигается путем выделения мононуклеарных клеток селезенки с последующим обогащением популяции CD пяти положительных лимфоцитов путем магнитного разделения клеток. Затем клеточную фракцию селезенки INKT дополнительно выделяют путем сортировки флуоресцентно активированных клеток.

На заключительном этапе отсортированные клетки INKT рассаживают для расширения in vitro. В конечном счете, цитокиновый профиль расширенных клеток INKT может быть оценен Элизой. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, поскольку очистка и расширение клеток ИНКТ требует комбинации различных методов.

Эту процедуру будет проводить аспирант из моей лаборатории. После сбора урожая селезенки перенесите ткань в нейлоновый фильтр 70 микрон, затем с помощью двухмиллилитрового поршня шприца аккуратно разомните селезенку через ситечко в коническую трубку объемом 50 миллилитров и промойте фильтр пятью миллилитрами PBS. Затем добавьте три миллилитра угольной пачки в 15-миллилитровую трубку и наложите градиент плотности на пять миллилитров клеточной суспензии.

Разделите ячейки центрифугированием и перенесите интерфейс в новую 15-миллилитровую пробирку. Затем промойте клетки в 10 миллилитрах холодной PBS и повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах факс-буфера, чтобы обогатить для CD пятью положительными лимфоцитами селезенки. Отрегулируйте разведение клеток до 10 до седьмой клетки на 90 микролитров с большим количеством факс-буфера и добавьте к клеткам 10 микролитров анти-CD пяти микрогранул.

Через 15 минут при четырех градусах Цельсия промойте ячейки четырьмя миллилитрами факс-буфера и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах свежего факс-буфера. Выделите пять положительных клеток CD путем магнитного разделения клеток в соответствии с рекомендацией производителя. Затем разбавьте обогащенные CD пять положительных лимфоцитов в соотношении 10 раз до шести клеток на 20 микролитров буфера, содержащего анти-CD 16, CD 32 и PE конъюгированные альфа-галы в воздухе CD 1D тетрамер при комнатной температуре в темноте через 30 минут, инкубируйте клетки с представляющими интерес антителами при температуре 4 градуса Цельсия в темноте еще 30 минут.

Затем промойте клетки в свежем факс-буфере и окрасьте их 10 микролитрами 20 микромолярного рабочего раствора DPI из расчета один умножить на 10 на шесть клеток в течение пяти минут. При комнатной температуре в настоящее время регистрируются примерно один раз по 10 до четверти обогащенные CD пятью положительными событиями лимфоцитов на проточном цитометре электронным путем с электронным стробированием на прямой разброс с низким содержанием клеток для исключения клеточных дублетов и агрегатов электронным способом. Выведите из DAPI положительных CD восемь положительных CD 19 положительных клеток в прямом рассеянии с низкой численностью населения и используйте графики бокового рассеяния и области прямого рассеяния.

Для электронного отбора лимфоцитов нанесите график альфа-гал SER CD 1D тетрамеры с помощью CD трех эпсилонов и электронным способом га альфа-гал сер CD 1D тетраммер-положительный CD три эпсилон-положительные клетки INKT, как показано. Затем, приобретая не более двух раз по 10 до пятого CD, пять положительных обогащенных лимфоцитов определяют процентное содержание альфа-gal SER CD, 1D тетрамера положительного CD, трех эпсилон-положительных клеток INKT, присутствующих в обогащенной клеточной фракции. Используя эту сортировку с низким затвором, альфа-альсер CD 1D тетрамер-положительный CD помещает три эпсилон-положительные клетки INKT в факсимильную трубку, содержащую один миллилитр эмбриональной сыворотки теленка в конце сортировки.

Промойте выделенные NKT-клетки со стороны факсимильной трубки 10 миллилитрами среды RPMI 1640. Затем раскрутите ячейки, повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре RPMI 1640 и используйте 40 микролитров аликвоты клеток для оценки чистоты отсортированных клеток. Использование той же стратегии стробирования.

Что касается настройки параметров сортировки, то для расширения клеток ИНКТ необходимо замедлить вращение клеток и ресуспендировать выделенные клетки в соотношении пять раз по 10 до пятой клетки на миллилитр в полной среде RPMI 1640 с добавлением ИЛ, двух ИЛ 12 и анти CD 28. Затем засейте клетки в количестве от 10 до 15 клеток INKT в лунку на 96 лунок с плоским дном и тремя эпсилонами, покрытыми тремя эпсилонами, и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для клеточных культур. Через два дня перенесите клетки в свежий 96-луночный планшет с плоским дном без покрытия для культивирования в условиях покоя в полном RPMI 1640.

Среда еще на два дня инкубации. На четвертый день после сортировки аккуратно внесите надосадочную жидкость в каждую лунку, чтобы выбить клетки и объединить их в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. После центрифугирования повторно суспендируйте нёбо в соотношении пять умножить на 10 до пятой клетки на миллилитр.

В полной РПМИ 16 среду дополняют ИЛ семь и затравку один раз по 10 до пятой клетки на лунку. В новую плоскодонную 96-луночную пластину верните клетки в инкубатор через четыре дня, вытащите их в свежую 15-миллилитровую коническую пробирку для центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулу в полной среде RPMI 1640, содержащей растворимый анти-CD-28, и засейте клетки на 96-луночную плоскую донную пластину, покрытую анти-CD тремя эпсилонами, в 10 раз по 10 пятых клеток на лунку, и верните клетки в инкубатор еще на три дня, четыре дня, с 11 по 18.

Повторите лечение IL 7 анти CD 28 и анти CD 3 эпсилоном, как показано на 19 день. Переложите клетки в новую коническую трубку объемом 15 миллилитров. Раскрутите их вниз и повторно суспендируйте гранулу в соотношении пять умножить на 10 до пятой ячейки на миллилитр в полной RPMI 1640.Medium.

Затем высейте клетки по 10-5 клеток на лунку в 96-луночный планшет с плоским дном и дайте клеткам отдохнуть в течение двух дней в инкубаторе для клеточных культур. Стимуляция отсортированных клеток INKT с помощью связанного с пластиной анти-CD-трех эпсилонов в присутствии IL-2, 2, IL-12 и растворимого анти-CD-28, приводит к примерно трехкратному увеличению числа INKT после двух дней культивирования. Последующая экспансия клеток INKT в присутствии IL 7 приводит к трех-четырехкратному увеличению количества клеток INKT, присутствующих на четвертый день в культуре.

Примечательно, что повторение этих условий культивирования может дать в среднем от семи до 10 до 7 клеток INKT после двух раундов экспансии без какой-либо видимой потери клеток между изменениями питательных сред в разные дни, что приводит к по меньшей мере 70-кратному расширению за 18 дней. Далее расширенные клетки INKT активируются пластинчатой связанной рекомбинантной мочкой. CD 1D, загруженный альфа-альсером, продуцируют IL два IL, четыре ИФН гамма, TNF альфа и IL 6 через 48 часов после стимуляции, демонстрируя, что клетки INKT сохраняют свою способность продуцировать TH один и TH два цитокина после экспансии.

При проведении этой процедуры важно помнить, что правильное окрашивание клеток INKT альфа-керамидами cdre имеет важное значение для идентификации клеток INKT во время проточной цитометрии. Уверенный.