Сайленсинг генов с помощью Morpholinos

Методы подавления экспрессии генов широко используются в области биологии развития. Подходы к нокдауну, основанные на морфолино, обычно позволяют исследователям идентифицировать и характеризовать гены, участвующие в важных клеточных процессах. Антисмысловые морфолино в настоящее время широко популярны во многих модельных системах, включая мышей, цыплят и рыбок данио, благодаря своей высокой эффективности, высокой специфичности и низкой стоимости.

В этом видео будет представлен обзор механизмов морфолино и стратегий микроинъекций, ключевых экспериментальных контрольных элементов и того, как морфолино используются в лабораториях сегодня для изучения развития позвоночных.

Морфолино впервые были разработаны как способ ингибирования трансляции транскриптов РНК в живых клетках и организмах. Как правило, морфолино представляют собой синтетические молекулы, состоящие из 25 олигонуклеотидов, соединенных нейтрально заряженным каркасом.

Но хотя морфолино могут выглядеть очень похоже на ДНК, они содержат морфолиновые кольца вместо сахарных групп, обнаруженных в фосфатно-сахарной основе. Это простое преобразование повышает стабильность морфолино в клетках и снижает стоимость их производства.

Внутри клеток морфолино нацелены на интересующую РНК путем комплементарного спаривания оснований. Расположение на РНК, где морфолино гибридизуется, определяет его специфический механизм действия.

Морфолины, блокирующие сплайс, связываются со специфическими соединениями и препятствуют надлежащей обработке транскриптов, в то время как морфолины, блокирующие трансляцию, связываются в пределах 5'-нетранслируемой области гена рядом с сайтом начала трансляции и предотвращают сборку рибосом. Оба типа морфолино снижают экспрессию функциональных белков-мишеней.

При планировании эксперимента с использованием морфолино следует помнить о нескольких важных соображениях. Morpholinos может быть использован в нескольких модельных системах, поэтому важно выбрать модель, способную решить рассматриваемый биологический вопрос.

Морфолино коммерчески синтезируются, и профессиональная помощь в разработке доступна для исследователей бесплатно, но поскольку они специфичны для последовательностей, генная информация для всех конкретных мишеней морфолино должна быть получена до проектирования.

В модельной системе рыбок данио часто встречаются две копии отдельных генов, обнаруженных у других позвоночных, из-за события дупликации всего генома, которое произошло у эволюционного предка рыбок данио. Таким образом, нокдаун обоих генов рыбок данио может быть необходим для успешного моделирования дефицита белка в развитии человека.

Разработка хороших экспериментальных средств контроля так же важна, как и разработка целевых морфолинов. Любой данный морфолино может связываться с определенными последовательностями в разных генах. Рекомендуется использовать независимые, не перекрывающиеся морфолины, комплементарные одному и тому же гену, чтобы гарантировать, что наблюдаемое фенотипическое изменение связано с нокдауном интересующего вас гена.

Теперь, когда мы рассмотрели экспериментальный дизайн морфолино, давайте посмотрим, как морфолино вводится в рыбки данио

.

Здесь мы опишем микроинъекцию морфолино рыбкам данио. Для получения дополнительной информации и инструкций по деталям микроинъекций, пожалуйста, обратитесь к обучающему видео JoVE Science Education под названием «Техники микроинъекций рыбок данио-рерио».

Морфолино обычно вводят эмбрионам рыбок данио между одно- и четырехклеточной стадией, в желток или цитоплазму клетки. Цитоплазматические связи между эмбриональными клетками обеспечивают быструю диффузию и повсеместную доставку водорастворимых морфолино по всему организму. Морфолино стабильны в клетках, так как эмбрион данио-рерио выращивается при температуре 28,5°C.

Оптимальные концентрации и объемы инъекций должны быть эмпирически проверены для каждого морфолино. Как правило, для того, чтобы избежать эмбриональной летальности или нежелательных побочных эффектов, используется самая низкая доза, при которой существует определенный надежный фенотип, по меньшей мере, у 50-75% вводимых эмбрионов.

Большинство фенотипов морфолино данио-рерио идентифицируются в первые три дня после оплодотворения, а подавление экспрессии генов, как правило, эффективно на пятый день. В случае морфолинов, блокирующих сплайс, ОТ-ПЦР может быть использована для идентификации относительных количеств нативных и измененных транскриптов. Для морфолинов, блокирующих трансляцию, уровни нокдауна гена могут быть оценены с помощью вестерн-блоттинга.

Быстрое внешнее развитие и прозрачность эмбрионов данио-рерио позволяют легко наблюдать за многими ранними биологическими процессами. Фенотипы морфолино обычно могут быть оценены путем анализа морфологии с помощью светлопольной или флуоресцентной микроскопии, а также путем оценки поведения.

После определения фенотипа морфолино можно выполнить спасение РНК для демонстрации специфичности мишени. После морфолинового нокдауна эндогенной мРНК вводится синтетическая мРНК, которая кодирует тот же белок, но не содержит последовательности-мишени морфолино. Если эта введенная РНК способна восстановить фенотип организма дикого типа, то можно сделать вывод, что наблюдаемый фенотип морфолино обусловлен именно тем, что ген-мишень был сбит с ног.

Теперь, когда у вас есть представление о том, что такое морфолино и как можно проводить контролируемые эксперименты с морфолино, давайте посмотрим, как морфолино применяются в биологических лабораториях сегодня.

В клеточной биологии морфолино используются для понимания ранних процессов развития. Одним из примеров является поток жидкости, генерируемый ресничками в везикуле Купфера, который контролирует лево-правый паттерн у рыбок данио. Поток жидкости идет против часовой стрелки у контрольных эмбрионов, в то время как подавление экспрессии гена, регулирующего организацию реснитчатых клеток, нарушает скорость и направление жидкости.

Морфолино также очень хорошо подходят для быстрого и надежного моделирования генетических заболеваний человека. Фенотипы потери функции могут быть легко воспроизведены путем манипулирования экспрессией белков, как это видно на модели дисплазии человека у рыбок данио, демонстрирующей кисты почек, отек перикарда и закрученный хвост. Кроме того, патогенные мутации могут быть быстро проанализированы in vivo с использованием мРНК дикого типа или мутантной мРНК для спасения фенотипов морфолинового заболевания.

Поскольку морфолино могут внедряться в живые клетки различными путями, они высоко ценятся при изучении регенерации и развития органов. Микроинъекция с последующей электрической стимуляцией морфолино в определенные ткани позволила исследователям изучить рост плавников и формирование сетчатки у взрослых рыбок данио.

Вы только что посмотрели введение JoVE в сайленсинг генов с помощью морфолинов. В этом видео мы обсудили структуру и механизм морфолинов, распространенные применения для использования, а также важные способы оценки эффективности и эффектов таргетного сайленсинга генов. Поскольку они просты в проектировании, высокоспецифичны и экономически эффективны, морфолино останутся важным игроком в области обратной генетики, помогая функционально анализировать гены, участвующие в заболеваниях и развитии. Спасибо за просмотр!