Пространственно-временная Отображение подвижности в

Общими целями создания комплексной пространственно-временной карты кишечника ex vivo являются изучение реакции на содержимое просвета путем наблюдения за детальным движением кишечной стенки на протяжении всего сегмента. Основным преимуществом данного метода является возможность регистрации и сравнения во времени и пространстве активности в различных областях одного и того же сегмента ткани, что позволяет выявлять сложные паттерны моторики, а не просто сокращение или расслабление. Хотя этот метод может дать представление о нормальной моторике кишечника, он также может быть применен для идентификации эффектов различных лекарственных препаратов и внутрипросветных агентов, таких как питательные вещества или паттерны моторики.

Как правило, лицам, впервые использующим данный метод, может быть трудно, так как на начальном этапе пространственно-временные карты могут быть сложны для интерпретации. Однако со временем можно будет с первого взгляда распознавать сложные закономерности. Для начала извлеките ободочную или тонкую кишку из эвтаназированной морской свинки.

Закрепите препарат в теплом растворе Кребса. В секционном лотке удалите все содержимое просвета, осторожно промыв его буфером Кребса. Используйте шприц с катетером с тупым концом и избегайте чрезмерного растяжения сегмента толстой кишки во время перфузии.

Затем прикрепите два отрезка полиэтиленовой трубки длиной 2-3 мм к двум стеклянным катетерам диаметром 3 мм с оплавленными концами. В подогреваемом лотке для диссекции вставьте один катетер в ротовой конец препарата ткани и завяжите шов за небольшим кусочком трубки вокруг катетера, используя хирургический узел. Осторожно попытайтесь вытянуть катетер назад, чтобы убедиться, что узел затянут плотно.

Небольшой отрезок полиэтиленовой трубки предотвращает соскальзывание шва. Повторите эту процедуру с другим катетером на аборальном конце ткани. Затем удалите брыжейку из тканевого препарата.

После фиксации обоих катетеров перенесите препарат из лотка для диссекции в одну из органных ванн GIMM и расположите ткань так, чтобы ротовой конец был направлен от пользователя. Затем закрепите стеклянные трубки катетеров в органной ванне с помощью модерирующей глины, прикрепив конец стеклянной трубки к стенке ванны, или с помощью пластиковых зажимов, закрепив катетеры на стойках над ванной, которые используются для фиксации камер. Теперь прикрепите отрезок трубки длиной 5 cm к открытому концу каждого катетера.

Для орального катетера соедините короткий отрезок трубки с более длинным отрезком трубки с помощью разъема Luer lock. Затем подсоедините шприц объемом 5 мл к фитингу Luer lock. Эта система будет использоваться для введения буфера в препарат ткани.

Для аборального катетера используйте трубку, чтобы направить люминальный отток в сборный контейнер. Теперь с помощью прилагаемого шприца медленно промойте ткань подогретым буфером Кребса, чтобы убедиться в наличии хорошего тока жидкости, что подтверждается вытеканием жидкости из аборального катетера. Далее приступайте к калибровке системы видеозаписи, пока ткань уравновешивается в течение 30 минут.

Откалибруйте высоту установки камеры, настройки яркости и контрастности видео, а также горизонтальное расстояние с помощью программного обеспечения GIMM. Перейдите на вкладку эксперимента, чтобы выбрать камеру для калибровки. Затем в меню File выберите Calibrate.

Как только видео появится в окне калибровки рабочей станции (calibrate workstation), установите камеру на такой высоте, чтобы в кадр попадали концы катетеров, введенных в просвет ободочной кишки. Затем откалибруйте горизонтальное расстояние, отображаемое на экране, используя полупрозрачную измерительную наклейку-линейку, прикрепленную к каждой ванне. В том же окне калибровки рабочей станции установите красные вертикальные направляющие так, чтобы расстояние между ними составляло 10 мм.

Затем введите это расстояние в окно курсора расстояния и нажмите кнопку Cal. Далее отрегулируйте ползунки усиления (gain), яркости (brightness) и выдержки (shutter) в окне калибровки рабочей станции, чтобы сегмент ткани выглядел как темный силуэт на светлом фоне. После этого подправьте ручки фокусировки и диафрагмы на самой камере для дальнейшего улучшения изображения.

Для завершения калибровки изображения нажмите Save, а затем Yes в появившемся окне. В завершение нажмите Exit. После тридцатиминутного периода уравновешивания начните эксперимент.

Начните с присвоения названия экспериментальному опыту. Затем перекройте просвет трубки, выступающей из аборального катетера, с помощью пластикового зажима. После этого введите примерно 7 milliliters буфера Кребса в проксимальный просвет ободочной кишки.

Цель состоит в том, чтобы обеспечить достаточное растяжение для инициации пропульсивных сокращений. Как только сегмент будет растянут просветной жидкостью, начните видеозапись. В программном обеспечении дважды щелкните по названию испытания, чтобы открыть вид с экспериментальной камеры, а затем переведите переключатель в положение «включено» (on), чтобы увидеть поле зрения камеры.

Запишите видеоданные заданной длительности. По завершении этого начального контрольного исследования растяжения ослабьте или снимите зажим, чтобы сегмент ткани вытолкнул расширяющую жидкость из просвета. Дайте ткани повторно стабилизироваться в течение 10–20 минут, после чего повторите процедуру с применением исследуемого препарата.

Один препарат ткани может подвергаться до пяти 10-минутных воздействий при условии соблюдения соответствующих интервалов отдыха между тестами. Обращайте внимание на отслоение слизистой оболочки, что свидетельствует о деградации ткани. Для анализа записи дважды щелкните по названию конкретного испытания, чтобы открыть окно анализа для построения ST-карты.

В области воспроизведения видео настройте ползунки контрастности и яркости так, чтобы изображение стало пригодным для анализа. Создайте черный силуэт ткани на светлом фоне. Затем установите горизонтальную и вертикальную красные направляющие в окне видеоизображения, чтобы выделить область ткани для анализа и исключить области, содержащие артефакты.

Затем установите время анализа. Нажмите зеленую кнопку A, чтобы выбрать начальную точку, и желтую кнопку B для выбора конечной точки, когда ползунок времени будет находиться в нужных положениях. Далее перейдите на вкладку Motor Analysis, чтобы открыть окно карты ST, и нажмите кнопку с изображением секундомера.

Начните создание ST-карты, нажав перекрестием курсора внутри черного силуэта ткани. Генерация карты может занять несколько минут. После построения ST-карты воспользуйтесь функцией масштабирования, чтобы увеличить изображение.

Затем выберите опцию «color», чтобы увидеть изображение в цвете вместо оттенков серого. Далее выберите «enable», чтобы с помощью курсора можно было выбрать пиксель для анализа. Для ткани, связанной с выбранными пикселями, анализируется изменение диаметра просвета с течением времени; результат отображается в виде графика изменения диаметра зерна справа от карты ST.

После завершения анализа выберите Exit. Теперь экспортируйте карту ST для дальнейшего использования: выберите File, затем Export Data и Metafile. Присвойте файлу имя и сохраните его в формате emf, нажав Save.

Карты, созданные с помощью данного метода, демонстрируют изменения просвета ткани как в пространстве, так и во времени. Горизонтальное расстояние отложено по оси X, а время — по оси Y, при этом начальное время находится сверху, а конечное — снизу. В правом верхнем углу расположена легенда, в которой указаны минимальный и максимальный диаметры просвета, а также масштаб для осей X и Y.

Таким образом, различные оттенки пикселей на полутоновом изображении соответствуют разным диаметрам просвета. Более темные пиксели соответствуют большему диаметру, а более светлые — меньшему. Сократительные волны кольцевой мышцы будут выглядеть как области с более светлой пикселизацией из-за уменьшения диаметра просвета.

Напротив, растяжение просвета, вызванное расслаблением кольцевой мышцы или большим пищевым комком жидкости, отображается более темными пикселями. Помимо волн распространяющегося сокращения, можно визуализировать паттерн перемешивающей моторики, известный как сегментация. Небольшие стационарные сокращения происходят в разных областях одновременно.

Со временем эти небольшие сокращения перемещаются к аборальному анальному концу. Остатки брыжеек на ткани могут создавать артефакты, которые проявляются в виде темных вертикальных линий. Горизонтальное перемещение этих артефактных вертикальных линий может быть использовано для определения времени сокращения продольных мышц.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать сегменты кишечника для видеозаписи и как создавать последующее представление моторики кишечника в виде пространственно-временных карт. Следуя этой процедуре, в люминальный раствор можно добавлять различные питательные вещества, чтобы определить, как природные компоненты индуцируют специфические паттерны моторики для облегчения пищеварения и всасывания. Использование специфических фармакологических агонистов или антагонистов рецепторов к нейрогуморальным агентам может применяться для определения механизмов инициации и распространения моторики.

Данный метод может помочь в получении данных, полезных для определения соединений, пригодных для лечения нарушений моторики.