Генная инженерия модельных организмов

Генная инженерия является ценным инструментом, используемым для модификации геномов модельных организмов в процессе, известном как трансгенез. В биологии развития этот подход часто используется для экспрессии модифицированных генов, которые могут быть визуализированы в живых тканях. В качестве альтернативы генная инженерия может быть использована для предотвращения или нарушения экспрессии белка для изучения функции развития конкретных генов.

В этом видео будут обобщены принципы, лежащие в основе этой технологии, рассмотрены некоторые процедуры генной инженерии и освещены способы использования этих методов в лаборатории.

Для начала давайте рассмотрим некоторые важные концепции, лежащие в основе трансгенеза. Это включает в себя встраивание ДНК в геном модельного организма. Существует ряд подходов в зависимости от цели исследования.

Во-первых, добавление измененного гена может выявить функциональные или морфологические изменения, вызванные мутацией. Другой метод заключается во введении дополнительных копий неизмененного гена дикого типа для изучения эффектов сверхэкспрессии, которая часто может быть столь же разрушительной, как и мутация. Другой подход заключается во вставке гибридного белка, содержащего визуализируемую метку, такую как зеленый флуоресцентный белок, для отслеживания местоположения и времени экспрессии генов у живых животных.

Сегмент ДНК, который будет вставлен в геном, должен быть тщательно спроектирован для получения желаемых паттернов экспрессии и результатов. Промотор, который является элементом последовательности, определяющим, когда и где экспрессируется ген, является важнейшим компонентом. Некоторые промоторы повсеместно экспрессируются почти во всех тканях, в то время как другие активны только в определенных тканях. Индуцируемые промоторы, которые активируются химическим введением или воздействием высоких температур, также могут быть использованы для контроля времени экспрессии генов.

Чтобы быть стабильно экспрессированным в тканях, трансген должен сначала интегрироваться в геном. Для этого трансгены могут включать в себя фланговые последовательности ДНК, которые соответствуют областям генома организма. Это позволяет трансгену интегрироваться с ДНК хозяина посредством процесса, известного как гомологичная рекомбинация. Кроме того, у некоторых видов специальные элементы, называемые транспозонами, могут сделать трансгенез более эффективным, включая сайты узнавания фермента транспозазы, который катализирует случайное встраивание трансгена в геном.

Теперь, когда вы знаете некоторые основы трансгенного дизайна, давайте рассмотрим, как создать трансгенное животное. Чтобы создать трансгенную конструкцию, начните с амплификации интересующего гена с помощью ПЦР. Затем эта амплифицированная область клонируется в вектор, который представляет собой фрагмент ДНК, способный переносить трансген в клетки. Векторы обычно содержат элементы, которые обеспечивают эффективную амплификацию трансгенов с помощью бактерий, таких как E. coli. После этой стадии амплификации вектор очищают от бактериальной культуры.

Трансгенные животные создаются путем введения очищенной ДНК в эмбрионы. У рыб и лягушек конструкции обычно вводятся непосредственно в желток или цитоплазму эмбрионов одноклеточной стадии. Для транспозон-опосредованного трансгенеза в смесь для инъекций добавляют транскрипт, кодирующий фермент транспозазу.

У мышей трансгенез может быть достигнут путем манипуляций с только что оплодотворенными яйцеклетками, в которых сперматозоид и пронуклеусы яйцеклеток еще не слились. Конструкция вводится непосредственно в более крупный пронуклеус, где она может интегрироваться в геном по мере деления клетки. Затем яйцеклетки должны быть пересажены в матку псевдобеременной самки для развития.

Эффективность трансгенеза варьируется, поэтому животных необходимо проверять для выявления потомства, в котором конструкция успешно интегрировалась в геном. Это можно сделать, найдя флуоресцентную метку, которая была вставлена для легкой идентификации, или с помощью молекулярного анализа, такого как ПЦР геномной ДНК, выделенной из небольших кусочков ткани.

Второй подход к генной инженерии фокусируется на нацеливании на конкретные гены для нарушения функции генов. Существует несколько подходов к достижению этой цели. Один относительно новый метод, известный как редактирование генома, использует преимущества последовательно-специфичных ферментов, называемых нуклеазами, которые разрезают основу ДНК и вызывают мутации в генах по мере восстановления ДНК.

Другой метод таргетирования включает использование гомологичной рекомбинации для замены гена либо чужеродной ДНК, либо копией гена, окруженной последовательностями узнавания ферментов, известными как рекомбиназы. Когда рекомбиназы присутствуют, фланкированная последовательность будет вырезана из генома. Это известно как условный нокаут, и контроль эксцизии гена может быть достигнут путем экспрессии фермента в определенных тканях или в определенные моменты времени.

Рассмотрим общую процедуру генерации нокаутных мышей методом гомологичной рекомбинации. Здесь должна быть подготовлена конструкция, в которой часть последовательности геномной ДНК заменяется чужеродной ДНК. Эта ДНК часто кодирует другой ген, например, устойчивый к антибиотикам, что дает возможность отбирать успешно модифицированные клетки на более поздних стадиях.

Чтобы начать процедуру, эмбриональные стволовые клетки собираются из внутренней клеточной массы эмбриона мыши на ранней стадии, известной как бластоциста. Линеаризованная конструкция затем доставляется в стволовые клетки с помощью электропорации, при которой электрические импульсы генерируют переходные поры в клеточной мембране. Затем клеткам дают инкубироваться в присутствии антибиотика для уничтожения клеток без трансгена.

После этого этапа отбора стволовые клетки могут быть введены в другой эмбрион мыши на стадии бластоцисты. Затем эмбрионы переносятся в матку самки мыши для продолжения развития. Получившиеся детеныши будут химерами, которые состоят как из ячеек дикого типа, так и из нокаут-клеток. У некоторых химер в зародышевой линии есть нокаутные клетки, которые будут передавать разрушенный ген при их скрещивании, что затем создаст новую нокаутную линию.

Вы изучили основы генной инженерии моделей развития, поэтому теперь давайте рассмотрим некоторые практические приложения.

В исследованиях развития часто используются флуоресцентно помеченные белки для идентификации клеток и изучения их развития. Используя тканеспецифические промоторы, трансгенные организмы могут быть сконструированы для экспрессии флуоресцентных белков в конкретных клетках, таких как нервный гребень. Используя передовые методы визуализации, флуоресцентные клетки могут быть визуализированы в режиме реального времени, что позволяет исследователям непосредственно визуализировать сложные события развития.

Еще одним важным применением генной инженерии является изучение конкретных генов и их роли в фенотипах заболеваний. Здесь целевые мутации вводятся в конкретный ген мыши с помощью нуклеаз, таких как TALENs. ПЦР показывает, есть ли у мыши ноль, одна или две копии мутировавшего гена. Эмбрионы, несущие две мутантные копии, теперь могут быть детально изучены, чтобы определить функцию развития гена.

Используя условные нокауты, ученые могут определить функцию гена в ограниченном наборе клеток. В этом случае ген loxP-фланкинга экспрессировался по всему эмбриону, но Cre экспрессировался только в эндотелиальных клетках, вызывая делецию гена в сердце и кровеносных сосудах. Этот тканеспецифический нокаут привел к измеримым изменениям частоты сердечных сокращений у эмбриона и иллюстрирует, как можно проверить локализованную роль гена без изменения всего организма.

Вы только что посмотрели представление JoVE о трансгенных технологиях. Эти методы помогут вам понять основы генной инженерии, некоторые из используемых методов и то, как она применяется в повседневной науке. Генная инженерия может быть широко применена ко многим организмам и будет оставаться важным инструментом для изучения и понимания роли генетики в заболеваниях развития, а также тех, которые появляются во взрослом возрасте. Спасибо за просмотр!