Эксплантная культура для исследований развития

Эксплант-культура — это метод, при котором целые ткани и органы удаляются из плода или эмбриона и культивируются из организма, или «ex vivo». Эти методы предоставляют уникальное окно, помогающее нам понять процесс развития, позволяя напрямую наблюдать за ростом органов и тканей — процессом, называемым органогенезом.

В этом видео будут рассмотрены основные принципы культивирования эксплантов, описаны ключевые этапы процедуры, обсуждены типичные манипуляции и представлены конкретные применения этой техники в исследованиях развития.

Прежде чем описывать, как культивировать эксплантации, давайте рассмотрим некоторые принципы, лежащие в основе этой техники.

Культура эксплантов применима к различным эмбриональным тканям из широкого спектра организмов. Этот метод идеально подходит для изучения развития органов, поскольку структурные изменения, известные как морфогенез, можно непосредственно наблюдать как функцию времени. Кроме того, ткани можно обрабатывать экспериментальными молекулами, чтобы определить их влияние на развитие. Более того, когда культура эксплантации сочетается с молекулярными инструментами для изменения экспрессии генов и флуоресцентной микроскопией, она становится мощным инструментом для решения вопросов дифференцировки клеток и тканей.

Далее рассмотрим протокол культивирования эксплантатов тканей млекопитающих.

Чтобы начать процедуру, у усыпленной беременной грызуньи извлекают эмбрионы. После удаления окружающих оболочек эмбрион изолируется. Затем представляющие интерес ткани или органы выделяют из извлеченного эмбриона и переносят в планшеты для роста. В среду добавляют антибиотики, и планшеты выращивают в инкубаторе при температуре 37°C. Теперь тканевые экспланты готовы к манипуляциям.

После того, как культуры эксплантов приживутся, можно провести несколько видов манипуляций.

Например, эксплантированная ткань может быть генетически модифицирована, чтобы проверить роль интересующего гена в конкретном процессе развития. Это может быть достигнуто путем введения генетического материала в ткань с помощью таких методов, как электропорация, при которой электрическое поле используется для введения ДНК в близлежащие клетки.

Экспланты также часто используются для проверки роли, которую сигнальные молекулы, такие как факторы роста, играют в органогенезе. Культивирование тканей in vitro особенно полезно для этих типов исследований, потому что лечение этим соединением так же просто, как добавление его в питательную среду. Тем не менее, небольшие бусины, пропитанные экспериментальными соединениями, также могут быть имплантированы в ткань для более контролируемого подхода к химической обработке.

Независимо от подхода, основным преимуществом метода экспланта является то, что эффекты экспериментальных манипуляций могут быть легко визуализированы в режиме реального времени с помощью световой или флуоресцентной микроскопии.

Теперь давайте рассмотрим некоторые конкретные применения культуры ex vivo.

Во-первых, экспланты представляют собой модельную систему, в которой развитие тканей может быть непосредственно визуализировано. Например, эти исследователи удалили развивающуюся поджелудочную железу у эмбриональных мышей и культивировали ее на чашках со стеклянным дном для улучшения визуализации.

Развитие ткани можно наблюдать с помощью световой микроскопии, но использование трансгенной ткани, экспрессирующей флуоресцентные маркеры, обеспечивает еще более детальное представление о процессах развития, таких как почкование канальцев. Эксплантированная ткань также может быть подвергнута иммуноокрашиванию, что позволяет исследователям контролировать развитие конкретных типов клеток, таких как инсулин-продуцирующие клетки, показанные здесь синим и зеленым цветом.

Еще одно применение эксплантных культур заключается в том, чтобы помочь расшифровать роль конкретных молекул, таких как факторы роста, в органогенезе.

Здесь экспланты легкого плода, препарированные из эмбрионов мышей E12.5, выращивали в присутствии или отсутствии фактора роста в течение 48 часов. Результаты показывают, что этот фактор роста препятствует образованию дыхательных путей в легких плода.

Наконец, экспланты из ранних эмбрионов могут быть использованы для определения механизмов, контролирующих экспрессию генов на первых стадиях эмбриогенеза.

Эти исследователи выделили два разных типа клеток из 16-клеточной стадии эмбрионов лягушек: те, которым суждено сформировать дорсальные структуры, и те, которые будут способствовать вентральным структурам. Эксплантам давали развиваться в течение примерно одного дня перед окрашиванием, чтобы охарактеризовать паттерн экспрессии гена, специфичного для дорсальной ткани.

Поскольку экспрессия этого гена наблюдалась только в эксплантах из дорсальной области, был сделан вывод, что программы экспрессии генов кодируются в этих эмбриональных клетках, а не управляются межклеточными взаимодействиями, которые происходят на более поздних этапах развития.

Мы рассмотрели системы культивирования эксплантов и рассмотрели, как они могут быть использованы в исследованиях развития. Этот метод является мощным инструментом, который помогает нам понять молекулярные механизмы, лежащие в основе развития животных. Спасибо за просмотр!