Сплошная гибридизация in situ

Цельная гибридизация in situ является мощным методом, который позволяет ученым понять молекулярную основу эмбрионального развития. «Целиком» означает, что будет использован весь эмбрион, а не только срез ткани. «In situ» — это латинская фраза, означающая «в положении». И, наконец, «гибридизация» относится к комплементарному связыванию синтетически произведенной молекулы РНК с транскриптом мРНК в клетке организма.

В этом видео будет продемонстрирована процедура, ожидаемые результаты и избранные применения этой техники, которые могут позволить лучше понять нарушения развития.

Гены, лежащие в основе морфогенеза организма, проявляются во временных и пространственных ограничениях в ходе эмбрионального развития.

Синтетически произведенные РНК-зонды, называемые рибозондами, используются для обнаружения мРНК путем комплементарного связывания. Рибозонды помечены специальными нуклеотидами, содержащими «гаптены», такими как динитрофенол, биотин или дигоксигенин. Гаптены — это молекулы, которые могут вызывать иммунный ответ при присоединении к более крупным молекулам и, следовательно, являются мишенями для связывания антител. Эти антитела конъюгированы с ферментами, такими как пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза, которые катализируют химические реакции, в которых может осаждаться флуоресцентный или цветной краситель.

Традиционные методы гибридизации in situ требуют подготовки участков ткани эмбриона для облегчения обнаружения внутренних структур. В результате, полная оценка экспрессии генов во всем организме должна быть реконструирована из срезов ткани размером 5-6 мкм с помощью компьютерного программного обеспечения. Тем не менее, с развитием методов цельного монтирования можно получить анализ экспрессии генов на больших расстояниях внутри всего эмбриона.

Рассмотрев принципы, лежащие в основе гибридизации in situ методом полного монтирования, давайте шаг за шагом рассмотрим протокол эксперимента.

Первым этапом этой процедуры является идентификация последовательности-мишени в исследуемом модельном организме. Затем целевую последовательность ДНК амплифицируют методом ПЦР с использованием праймеров, содержащих последовательности инициации РНК-полимеразы. Амплифицированная матрица ДНК теперь транскрибируется in vitro с помощью нуклеотидов, меченных гаптенами. Этот меченый гаптеном рибозонд теперь готов к этапу гибридизации.

Эмбрионы подготавливаются к гибридизации путем фиксации формальдегидом, сшивающим реагентом, который стабилизирует белки и защищает от РНКазы. После фиксации формальдегид удаляют путем многократной промывки эмбриона фосфатно-солевым раствором, содержащим небольшое количество моющего средства, такого как Tween. Чтобы удалить клеточные липиды и облегчить проникновение зонда в ткани, эмбрионы обезвоживают в поэтапной серии промывок метанолом, например: 25%, 50%, 75%, 100% метанол. Эмбрионы могут храниться в 100% метаноле до одного месяца (или более) при температуре -20°C.

Чтобы подготовить эмбрионы к гибридизации, они должны быть регидратированы с помощью поэтапной серии промывок метанолом с постепенно уменьшающимся количеством метанола на одну промывку. Затем эмбрионы перевариваются с помощью протеазы, чтобы облегчить диффузию рибозонда в ткани. Меченый рибозонд добавляется к эмбриону и проводится гибридизация.

Постгибридизационные промывки проводятся для удаления неспецифических гибридизаций. РНКазы А и Т1 добавляются для удаления не полностью гибридизованных зондов путем расщепления одноцепочечной РНК. Гибридизованные зонды детектируются с помощью конъюгата антитело-фермент, который связывается с мечеными гаптенами рибозондами. Как упоминалось ранее, ферменты, такие как щелочная фосфатаза, конъюгированы с гаптен-специфическими антителами и обнаруживаются путем добавления ферментных субстратов для изменения цвета. Продукт реакции образует темно-фиолетовый осадок, обозначающий местоположение экспрессированной мРНК, как видно в этом примере.

Теперь, когда вы знаете, как проводить гибридизацию in situ целиком, давайте рассмотрим некоторые применения этой техники.

Цельная гибридизация in situ была использована, чтобы помочь ученым бороться со смертельными болезнями, переносимыми комарами, такими как малярия, лихорадка денге и болезнь Западного Нила. Характеризуя гены, участвующие в размножении и развитии комаров, можно разработать новые биологические или химические инсектициды, которые будут лучше нацелены на комаров-переносчиков болезней.

Еще одно применение этого метода включает в себя характеристику изменений паттерна экспрессии генов, связанных с воздействием тератогенов, или агентов, которые препятствуют развитию плода.

В данной работе в модели фетального алкогольного синдрома у рыбок данио была использована полноразмерная гибридизация in situ для идентификации генов, паттерны экспрессии которых изменяются после воздействия алкоголя. Это может помочь в разработке методов лечения для смягчения последствий внутриутробного воздействия алкоголя.

Цельная гибридизация in situ также может быть использована для валидации фенотипических изменений, связанных с врожденными заболеваниями. Мутации, связанные с синдромом Барде-Бидля, были введены в эмбрионы рыбок данио с помощью синтетически произведенных мутантных мРНК. По прошествии определенного периода времени эмбрионы были разделены на группы в зависимости от тяжести дефектов. Визуализация экспрессии генов после мутировавшего гена была использована для подтверждения фенотипических изменений. Таким образом, полная гибридизация in situ в сочетании с фенотипической оценкой может способствовать лучшему пониманию роли специфических мутаций, лежащих в основе дефектов развития.

Вы только что посмотрели видео JoVE о гибридизации in situ методом полного монтажа. Этот метод является мощным инструментом, который позволяет точно определить временные и пространственные характеристики экспрессии генов в организме. В настоящее время для создания атласа паттернов экспрессии генов во время развития во множестве модельных организмов используется гибридизация in situ в целом. Эти исследования могут способствовать разработке новых терапевтических средств для лечения заболеваний человека, включая рак. Спасибо за просмотр!