Способ оценки подкрепляющих свойств этанола в Крысы без воды депривации, сахарин выцветания или дополнительного обучения доступа

Общая цель данного протокола — быстро инициировать оперантное реагирование крыс на алкоголь с помощью метода, удобного для экспериментатора и, в отличие от стандартных методов, не требующего лишения воды или постепенного снижения концентрации сахарина или сахарозы (fading). Таким образом, данный метод является очень полезным инструментом для поиска ответов на ключевые вопросы о нейробиологии и нейрофармакологии вознаграждения алкоголем при поиске алкоголя крысами. Главным преимуществом этой техники является то, что для инициации реагирования крыс на алкоголь не требуется постепенное снижение концентрации сахарина или сахарозы.

Сначала необходимо исключить возможный негативный эффект использования подсластителей в процедуре самовведения этанола. Для данного эксперимента возьмите крыс весом от 200 до 225 граммов. В данной работе используются самцы линии Wistar.

Разместите животных по отдельности или парами, в зависимости от целей эксперимента. Содержите колонию в режиме обратного 12-12-часового цикла свет-темнота при контролируемой температуре и влажности; проводите эксперименты в темную фазу. Взвешивайте животных еженедельно и обеспечьте период акклиматизации не менее одной недели перед началом эксперимента.

Не ограничивайте доступ крысы к пище и воде; это не требуется для кондиционирования. Проводите все поведенческое обучение в оперантной камере одного и того же размера, оснащенной решеткой для подачи стимулов и поддоном для отходов.

Камера должна быть установлена в вентилируемую звукоизоляционную кабину. Каждая камера должна быть оснащена стимульными лампами, шприцевыми насосами и двумя выдвижными рычагами. Рычаги должны быть расположены по бокам от приемника в виде стаканчика для жидкости.

Каждая камера должна находиться под автоматическим управлением с помощью компьютерного интерфейса. Используйте данное программное обеспечение для подготовки программы оперантного обусловливания по мере необходимости. Например, выполните следующие команды.

Выдвиньте два рычага, чтобы отметить начало сессии и сигнализировать о доступности алкоголя. Настройте рычаг этанола так, чтобы при нажатии в прилегающую поилку подавалось 100 µL 20% этанола, с последующим периодом ожидания в пять секунд. Сигнализируйте о периоде ожидания с помощью светового индикатора над рычагом.

Другой рычаг при нажатии не вызывает запрограммированного последствия и служит контролем для неспецифического поведения. Даже во время перерывов фиксируйте, как крысы используют рычаги, несмотря на отсутствие последствий для животного. Через 30 минут втяните оба рычага, чтобы сигнализировать об окончании сессии.

Загрузите в шприц раствор этанола, приготовленный из 95% ethanol и водопроводной воды. Вытесните раствор, не допуская попадания пузырьков воздуха в линии подачи. Вручную убедитесь в наличии потока раствора.

Всегда тестируйте устройства вручную. Также всегда просушивайте емкость для раствора перед началом каждого сеанса. Перед началом сеанса загрузите программное управление и убедитесь, что все системы работают исправно.

Переместите крыс в помещение для тестирования в транспортной клетке и распределите по одной крысе в каждую камеру. Поддерживайте в помещении для тестирования такую же температуру и влажность, как в вивариуме. Помещайте крыс в камеры единообразно и в одно и то же время дня для каждого сеанса.

Затем запустите программное обеспечение для начала сессии. После завершения сессии верните крыс в виварий и очистите клетки для оперантного обусловливания с помощью дезинфицирующего средства. Проводите сессии ежедневно, пять или шесть раз в неделю.

После каждого сеанса рассчитывайте среднее количество нажатий на активный и инактивный рычаги, а также количество полученных порций алкоголя. Считается, что показатели стабилизировались, если на протяжении трех последовательных сеансов количество наград варьируется не более чем на 15%. После достижения стабильного базового уровня поведения с крысами можно проводить манипуляции. Одним из возможных вариантов манипуляции с крысами на стабильном базовом уровне является оценка их мотивации к получению этанола.

Для этого подвергните животных прогрессивному графику подкрепления. Запрограммируйте камеры таким образом, чтобы изначально один объем алкоголя выдавался за одно нажатие рычага, но количество необходимых нажатий увеличивалось после каждого полученного подкрепления алкоголем. Каждое животное достигнет точки разрыва, соответствующей количеству нажатий, совершенных для получения последнего подкрепления.

Данная модель была протестирована на прогностическую валидность с использованием налтрексона — одобренного препарата для лечения алкогольной зависимости. Прогностическая валидность была подтверждена, следовательно, модель может быть использована для оценки новых потенциальных лекарственных средств. Для начала введите крысам физиологический раствор за 30 минут до каждой сессии, чтобы приучить их к инъекциям.

Проанализируйте результаты сессий и продолжайте работу, когда количество наград между двумя последними сессиями варьируется на 15% или менее. Затем введите налтрексон в физиологическом растворе с pH, доведенным до нейтрального значения. Рандомизируйте порядок тестирования между различными группами лечения и необработанными контрольными группами.

В промежутках между введением препаратов каждую крысу следует подвергнуть двум обычным сеансам без лечения, используя только физраствор. Это служит периодом вымывания и возвращает крысу в исходное состояние. Повторяйте тесты до тех пор, пока каждая обученная крыса не получит каждый уровень лечения один раз, а также контрольное воздействие один раз.

После анализа данных можно выбрать наиболее эффективную дозу для использования на животных при тестировании с прогрессивным соотношением. С использованием описанного протокола 239 крыс из восьми различных когорт были обучены самостоятельному введению алкогольного вознаграждения без депривации воды или постепенного снижения концентрации сахарина/сахарозы. Крысы быстро начали нажимать на рычаг, получая более 10 вознаграждений в первой сессии.

В конечном итоге крысы достигли стабильной частоты реакций, получая около 24 подкреплений за каждую получасовую сессию. Препарат налтрексон, одобренный FDA, тестировался в трех концентрациях. Как и ожидалось, введение налтрексона вызвало дозозависимое снижение уровня самовведения алкоголя, что обеспечило важную фармакологическую валидацию данного протокола.

Как и ожидалось, налтрексон снизил мотивацию крыс к употреблению алкоголя при использовании графика прогрессивного соотношения, что подтверждается снижением показателя точки разрыва. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое понимание того, как быстро инициировать оперантный ответ крыс на этанол без использования депривации воды или процедуры постепенного замещения сахарином/сахарозой. При использовании данного протокола крысы достигают стабильных показателей самовведения примерно за две недели, что приводит к фармакологически значимым концентрациям алкоголя в крови.

При выполнении данной процедуры важно максимально поддерживать стабильность повседневных условий. Также критически важно, чтобы этанол правильно подавался в приемник после первого подкрепленного ответа, поскольку любой сбой может изменить или задержать процесс освоения самовведения этанола. После завершения данной процедуры можно проводить другие эксперименты для изучения нейронных механизмов поиска и потребления алкоголя.