Введение в биологию стволовых клеток

Как следует из их названия, стволовые клетки являются предшественниками, из которых многие различные типы клеток являются «стволовыми». Они характеризуются своей эффективностью, или способностью дифференцироваться в клетки из всех трех зародышевых слоев, а также их способностью к образованию большего количества стволовых клеток. В надежде продвинуться вперед в области биологии развития и регенеративной медицины, исследователи стволовых клеток работают над тем, чтобы понять, как эти уникальные клетки совершают такой большой подвиг.

В этом видео рассказывается об основных открытиях в области биологии стволовых клеток, ключевых вопросах, задаваемых учеными в этой области, основных методах, используемых исследователями стволовых клеток, и приложениях исследований стволовых клеток.

Теперь, когда мы представили концепцию стволовых клеток, давайте погрузимся в богатую историю исследований стволовых клеток.

В 1960-х годах доктора Эрнест Маккалох и Джеймс Тилл обнаружили некоторые из первых окончательных доказательств существования гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге взрослых млекопитающих. Эти клетки обладают способностью к самообновлению и являются мультипотентными, что означает, что они могут дифференцироваться в множественные, но ограниченные типы клеток, а именно клетки крови и иммунной системы.

В 1988 году Ирвинг Вайсман и его коллеги усовершенствовали метод очистки гемопоэтических стволовых клеток из костного мозга мышей.

В 1981 году профессор Гейл Мартин ввела термин «эмбриональная стволовая клетка». В отличие от гемопоэтических стволовых клеток, эмбриональные стволовые клетки являются плюрипотентными, обладая способностью дифференцироваться во все типы клеток организма. Она и ученые Мартин Эванс и Мэтью Кауфман одновременно, но по отдельности, разработали методы извлечения внутренней клеточной массы из бластоцист мышей и культивирования их in vitro в качестве стволовых клеток.

В 1998 году, более чем через десять лет после выделения эмбриональных стволовых клеток мыши, доктор Джеймс Томсон успешно создал первые линии человеческих эмбриональных стволовых клеток.

В 2006 году произошел крупный прорыв с появлением индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, разработанных доктором Шинья Яманака. Основываясь на работе Джона Гердона, Яманака разработал метод перепрограммирования дифференцированных клеток в плюрипотентное состояние с использованием ретровируса для индуцирования экспрессии небольшого набора транскрипционных факторов, теперь известных как «факторы Яманаки». Полученные клетки были названы «индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками» или «иПСК». Эти эксперименты были признаны настолько принципиально важными, что Яманака и Гурдон были удостоены Нобелевской премии в 2012 году.

В настоящее время у нас есть модели iPSC нескольких заболеваний человека и платформы регенерации в нескольких тканях.

Сегодня исследования стволовых клеток обусловлены несколькими всеобъемлющими вопросами.

Один из самых важных из этих вопросов: как стволовые клетки поддерживают плюрипотентность и возобновляемость? Есть две взаимосвязанные характеристики стволовых клеток, которые наделяют их этими свойствами. Во-первых, это экспрессия специфических генов, необходимых для стволовости и самообновления. Второй – это реакция стволовых клеток на регуляторные факторы, влияющие на экспрессию этих генов.

Следующий логичный вопрос: как направлена дифференцировка стволовых клеток? По мере того, как стволовая клетка превращается в зрелую клетку, активация специфических путей дифференцировки вызывает изменения в экспрессии генов, отключая гены стволовых клеток и активируя тканеспецифические гены, что приводит к увеличению специализации клеточных функций и морфологии.

Наконец, давайте обратимся к главному вопросу, стимулирующему финансирование исследований стволовых клеток: можно ли использовать стволовые клетки для лечения болезней? Регенеративная медицина решает этот вопрос двумя способами: 1) путем выращивания органов в лаборатории и 2) путем доставки стволовых клеток с помощью трансплантации для лечения дегенерации тканей.

Теперь, когда мы представили некоторые ключевые вопросы, касающиеся биологии стволовых клеток, давайте рассмотрим некоторые из основных методов, используемых для их решения.

Технология микрочипов может быть использована для определения того, какие гены обеспечивают активность и возобновляемость стволовых клеток. В этом методе общая РНК выделяется из популяции клеток, которая выступает в качестве моментального снимка текущей экспрессии генов. В ряде этапов эта мРНК преобразуется в флуоресцентно меченный зонд и гибридизируется с чипом, содержащим транскрипты всего генома человека. Сканирование этого чипа обеспечивает считывание относительных профилей экспрессии генов. Как видите, стволовая клетка экспрессирует определенный набор генов, который отличается от дифференцированной клетки.

Другой анализ генов плюрипотентности включает в себя систему обнаружения Oct4-GFP. Oct4 необходим для самообновления и быстро снижается во время дифференцировки. Поэтому его экспрессия выступает надежным индикатором «стволовости». В этом эксперименте клетки экспрессируют зеленый флуоресцентный белок под контролем промотора Oct4. Затем этими клетками можно манипулировать экспериментально, а изменения в экспрессии GFP анализируются для выявления новых генов или растворимых факторов, которые модулируют самообновление.

Чтобы изучить стволовые клетки in vitro, мы должны сначала понять, как их культивировать. Стволовым клеткам требуется определенное микроокружение для поддержания стволовости. Это может быть достигнуто путем совместного культивирования стволовых клеток с фидерными клетками, такими как эмбриональные фибробласты мыши, или MEF. МЭФ выделяют сложную смесь необходимых плюрипотентных и самообновляющихся факторов.

Иногда желательно иметь беспитательные культуры стволовых клеток. Основным методом поддержания свободных от фидеров клеточных линий является дополнение питательных сред клеточных культур стоковыми реагентами роста и ингибирующих факторов.

Дифференцировка стволовых клеток in vitro осуществляется с помощью нескольких методов. Дифференциальная экспрессия генов в конечном итоге отвечает за специализацию клеток. В двухступенчатом методе, который вы видите здесь, культивируемые эмбриональные стволовые клетки мыши подготавливаются к судьбе нейронов, прежде чем они будут дифференцированы с помощью среды индукции моторных нейронов. Эти факторы активируют специфические пути экспрессии генов, что приводит к морфологическим и протеомным изменениям, характерным для моторных нейронов.

Одним из основных недостатков традиционной дифференцировки in vitro является то, что плоские пластины ограничивают трехмерный рост клеток. Метод висячих капель и методы микрокапсул позволяют обойти эти проблемы. В технике подвешенных капель небольшие капли суспензий стволовых клеток наносятся на крышку чашки Петри и культивируются вверх ногами с образованием агрегатов стволовых клеток, известных как эмбриоидные тельца.

При методах микрокапсуляции стволовые клетки смешиваются с биосовместимой полупроницаемой мембраной, называемой альгинатом, и помещаются в виде гранул в пластины для клеточных культур. Оба метода позволяют осуществлять дальнейшую дифференцировку в специализированные клетки, такие как дофаминергические нейроны и кардиомиоциты.

Знание того, как проводить прямую дифференцировку, является важным шагом на пути к использованию стволовых клеток в регенеративной медицине. Терапия трансплантацией стволовых клеток направлена на лечение и излечение дегенеративных заболеваний путем восстановления поврежденных тканей с помощью стволовых клеток. В этом эксперименте соматические клетки пациентов перепрограммируются в iPS-клетки посредством лентивральной инфекции факторов Яманаки. Из своего плюрипотентного состояния клетки дифференцируются в определенные типы клеток и возвращаются к хозяину для восстановления поврежденной ткани.

Теперь, когда вы знаете некоторые методы, используемые для исследования стволовых клеток, давайте рассмотрим, как эти методы применяются в конкретных экспериментах.

В этом эксперименте с использованием мышиной модели рассеянного склероза нейральные стволовые клетки вводятся внутривенно пораженным мышам. Срезы мозга обработанных мышей собираются и визуализируются под микроскопом для оценки успешности трансплантации. Клетки, полученные из клеток-предшественников донорских нейронов, отслеживаются с помощью репортерного гена LacZ. Как видите, ряд донорских стволовых клеток дифференцировался и интегрировался в центральную нервную систему больных мышей.

Не каждый недуг поддается лечению с помощью системных инъекций. Повреждения хряща, например, требуют специального каркаса для восстановления. В этом эксперименте смесь мезенхимальных стволовых клеток и факторов свертывания культивируется вместе с образованием сгустка. Затем сгусток помещается в поврежденный коленный хрящ кролика и позволяет ему интегрироваться. После этой процедуры можно наблюдать ремоделирование коленного хряща до гладкого и функционального сустава.

Иногда исследователи стволовых клеток и инженеры тканей объединяются, чтобы восстановить целые органы. В этом эксперименте легкие приматов промываются для децеллюляризации органа, оставляя после себя только неклеточные структурные компоненты. Это «призрачное» легкое затем переносится в биореактор, где его засаживают сосудистыми и эпителиальными стволовыми клетками. Чтобы еще больше имитировать давление и поведение, которые испытывают естественные легкие, биореактор осуществляет циркуляцию среды, поддерживает давление и уровень газа, а также надувает легкие.

Вы только что посмотрели обзор биологии стволовых клеток от JoVE. Подводя итог, в этом видео мы обсудили стволовые клетки и их историю, методы поддержания, дифференцировки и доставки, а также применение стволовых клеток. Спасибо за просмотр!