Баки-сигнализировал Классическая кондиционирования ока в голове фиксированных мышей

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы использовать генетические достижения у мышей и наше понимание системы усов для исследования нейробиологической основы обусловливания морганием глаз, переводимой парадигмы для изучения обучения и памяти. Этот метод может помочь ответить на механистические вопросы в обучении и памяти с помощью визуализации кальция и электрофизиологии у генетически модифицированных мышей, стимулируя при этом специфические усы во время кондиционирования. Основным преимуществом этой методики является возможность закрепить головы мышей при минимизации напряжения, позволяя мышам передвигаться в своем собственном темпе по цилиндрической беговой дорожке.

Последствия этого метода распространяются на потенциальные методы лечения нарушений памяти, в том числе связанных с нормальным старением и болезнью Альцгеймера. Подготовка цилиндра и система стимуляции усов описаны в текстовом протоколе. В этом разделе рассматривается подготовка головного передатчика.

Полоса для головного перетека представляет собой напечатанную на 3D-принтере полосу с семью отверстиями, созданную на основе нейлоновой полосы серии Amphenol 221, которая больше не производится в промышленных масштабах. Из напечатанного на 3D-принтере детали простучите по первому отверстию в полосе от 0 до 80 с помощью винта на один дюйм и оставьте одно отверстие пустым после первого отверстия. Далее с помощью тисков вставьте пять позолоченных булавок в оставшиеся пять отверстий.

Проденьте штифты через более узкие отверстия в пластике. Далее с помощью термопластыря зачистите полсантиметра полиимидного покрытия. Затем припаяйте зачищенный конец к одному из контактов, где у контакта есть отверстие.

Отрежьте паянный провод на расстояние от шести до семи миллиметров и зачистите около двух миллиметров провода. Теперь повторите этот процесс, чтобы присоединить четыре провода в общей сложности к пяти контактам. Первые два провода будут регистрировать реакцию ЭМГ век, в то время как вторые два будут доставлять электрическую стимуляцию в периорбитальную область.

К пятому контакту припаяйте неизолированный пятисантиметровый провод из нержавеющей стали, который будет служить электрическим заземлением. После выполнения всех соединений проверьте каждое из них с помощью мультиметра, чтобы убедиться в их электрической непрерывности. Начните с животного под полным наркозом, подтвержденным пощипыванием пальца ноги.

Введите дозу бупренорфина гидрохлорида в качестве обезболивающего средства. Затем нанесите небольшое количество офтальмологической мази на роговицу и побрейте макушку головы животного. Далее закрепите голову животного на стереотаксической раме и продезинфицируйте кожу головы тремя чередующимися скрабами из повидон-йода и спирта.

Лезвием скальпеля No 10 или 15 сделайте надрез по средней линии волосистой части головы, обнажая череп от передней части глаз до межтеменной кости. Втяните лоскуты кожи с помощью шести микрозажимов, обнажив как можно большую часть черепа, включая бока и спину. Затем с помощью скальпеля соскребите надостий с черепа.

Затем трижды очистите верхнюю часть черепа 3%-ной перекисью водорода. Как только череп высохнет, просверлите два отверстия с перевернутым конусом размера 34, стараясь не повредить мозг. Поместите одно отверстие перед брегмой, а другое — перед лямбдой, слева от средней линии при тренировке правого глаза, или наоборот.

Эти отверстия должны быть тщательно просверлены, чтобы подогнать винты, и приложить большие усилия, чтобы не повредить мозг. В отверстия вставьте винты для электрических соединений. Каждый полный оборот будет опускать винт на 0,28 миллиметра, поэтому двух полных оборотов достаточно.

Затем создайте несколько небольших дивитов на черепе, чтобы увеличить площадь поверхности для цемента. От готового насадки намотайте провод заземления в форме восьмерки вокруг двух винтов. Оставьте небольшой провис в проводе заземления, чтобы головной передатчик можно было правильно расположить.

Теперь нанесите холодный фиксирующий цемент. Обильно смажьте череп и шурупы и дайте цементу высохнуть. Как только цемент высохнет, расположите головной убор вертикально, так, чтобы штифты стояли над черепом.

Закрепите головной передатчик с помощью держателя, прикрепленного к кронштейну из рамы. Держатель должен иметь пять позолоченных гнезд для приема штифтов головного передатчика. Расположите два провода ЭМГ на круговой мышце глаза над глазницей.

Затем расположите два стимулирующих провода. Зачищенные концы положите под кожу на два-четыре миллиметра прямо каудально к глазу. Не позволяйте их концам соприкасаться друг с другом.

Если провода настолько длинные, что на них можно поцарапать глаз животного, обрежьте их назад или загните назад. Часть оголенного провода должна оставаться открытой. Теперь зацементируйте основание проводов к черепу еще немного фиксирующим цементом и дайте ему высохнуть.

Используйте примерно половину ранее использованного объема. Чтобы продолжить, снимите микрозажимы и измените положение кожи. Дайте коже осесть естественным образом, чтобы предотвратить натяжение кожи, которое может исказить веко, препятствовать морганию и тем самым испортить эксперимент.

Как только кожа осядет, снимите держатель головного передатчика и заклейте открытое место стоматологическим цементом. Избегайте попадания капли цемента на глаза или штифты головного убора. Затем используйте ватный тампон, смоченный растворителем стоматологического цемента, чтобы разгладить и при необходимости манипулировать частично отвержденным цементом.

Как только цемент полностью высохнет, снимите животное со стереотаксической рамки и дайте ему восстановиться на теплой поверхности, прежде чем вернуть его в домашнюю клетку. Начинайте приучать мышей после того, как у них будет по крайней мере пять дней на восстановление. Чтобы обезопасить мышь, ненадолго задержите ее за хвост, чтобы зажать за плечи.

Затем поднимите мышь из-под живота и туловища. Далее подсоедините разъем к головному устройству и поверните стопорный винт. Затем аккуратно поместите мышь на цилиндр и удерживайте ее неподвижно, используя два винта, чтобы закрепить разъем на стержнях над цилиндром.

Затем отпустите мышку. Во время первых двух сеансов дайте мышке привыкнуть к цилиндру в течение того же времени, что и во время сеанса физической подготовки. Во время привыкания записывайте частоту спонтанного моргания.

Кроме того, предварительно подвергните мышей воздействию вибростимулятора усов без применения электрической стимуляции. Когда пьезосистема находится близко к кондиционированной стороне, наденьте зубья расчески на отдельные усы. Выбирайте одни и те же усы для каждого сеанса.

Затем приступайте к классической тренировке, как показано в тексте. Восьми-десятинедельные самцы мышей C57 Black 6J обучались коррекции следа моргания глаз на цилиндрической беговой дорожке с фиксированной головкой. Были сделаны записи ЭМГ каждого испытания.

ЭМГ были выпрямлены и интегрированы с 10-миллисекундной временной постоянной, а затем усреднены по всем испытаниям. Эволюция условных повторений в течение 10 тренировок показывает, что постепенно амплитуда реакции увеличивалась, а задержка реакции сокращалась. Эта эволюция не прослеживается в ответах мышей, у которых стимулы представлены в случайном порядке.

Эволюцию своевременных и, следовательно, хорошо усвоенных условных реакций также можно увидеть на гистограммах времени до пика реакции после начала КС. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить головной передатчик, хирургически вживить головной убор мыши на мышь и разместить мышь на цилиндрической беговой дорожке для фиксации мигания головой. Ваши мыши должны демонстрировать хорошую кривую обучения в течение нескольких дней по мере того, как они приобретают физическую форму.

После освоения этой техники ее можно выполнить за один час, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что нужно сохранять бдительность, наблюдая за любыми неприятными ощущениями от животных. Следует предпринять соответствующие шаги для того, чтобы свести к минимуму стресс для животных.