Баки-сигнализировал Классическая кондиционирования ока в голове фиксированных мышей

Общая цель данного протокола заключается в использовании достижений в области генетики мышей и нашего понимания системы вибрисс для исследования нейробиологических основ кондиционирования мигания — трансляционной парадигмы изучения обучения и памяти. Этот метод позволяет ответить на механистические вопросы об обучении и памяти с помощью кальциевого имиджинга и электрофизиологии у генетически модифицированных мышей при одновременной стимуляции конкретных вибрисс в процессе кондиционирования. Основным преимуществом данной методики является возможность фиксации головы мыши при минимизации стресса, так как животные могут передвигаться в своем собственном темпе на цилиндрической беговой дорожке.

Значение данной методики распространяется на возможные способы лечения нарушений памяти, в том числе связанных с нормальным старением и болезнью Альцгеймера. Подготовка цилиндра и системы стимуляции вибрисс подробно описаны в текстовом протоколе. В данном разделе рассматривается подготовка головного крепления.

Полоска головки представляет собой напечатанную на 3D-принтере полоску с семью отверстиями, созданную по образцу нейлоновой полоски серии Amphenol 221, которая больше не производится коммерчески. В напечатанной детали нарежьте резьбу в первом отверстии полоски под машинный винт 0-80 длиной один дюйм, оставив следующее за первым отверстие пустым. Затем, используя тиски, установите пять позолоченных контактов в оставшиеся пять отверстий.

Проденьте контакты через более узкие отверстия в пластике. Затем с помощью термостриппера снимите полиимидное покрытие с конца контакта на полсантиметра. После этого припаяйте зачищенный конец к одному из контактов в месте, где имеется отверстие.

Обрежьте припаянный провод до длины от шести до семи миллиметров и зачистите около двух миллиметров изоляции. Повторите эту процедуру, чтобы в общей сложности прикрепить четыре провода к пяти контактам. Первые два провода будут использоваться для регистрации ЭМГ-ответов века, а вторые два — для подачи электрической стимуляции в периорбитальную область.

К пятому контакту припаяйте неизолированный провод из нержавеющей стали длиной пять сантиметров, который будет служить электрическим заземлением. После завершения всех соединений проверьте каждое из них с помощью мультиметра для подтверждения их электрической целостности. Начните процедуру с полностью анестезированного животного, подтвердив состояние отсутствием реакции на щипок за палец.

Введите дозу бупренорфина гидрохлорида в качестве анальгетика. Затем нанесите небольшое количество офтальмологической мази на роговицы и выбрейте шерсть на макушке животного. После этого зафиксируйте голову животного в стереотаксической раме и продезинфицируйте кожу головы, трижды чередуя обработку раствором повидон-йода и спиртом.

С помощью скальпеля с лезвием № 10 или 15 сделайте разрез по средней линии волосистой части головы, обнажая череп от передней части глаз до области за межтеменной костью. Отодвиньте кожные лоскуты с помощью шести микрозажимов, максимально обнажая череп, включая боковые и задние поверхности. Затем с помощью скальпеля соскоблите надкостницу с черепа.

Затем трижды очистите верхнюю часть черепа 3% hydrogen peroxide. После высыхания черепа просверлите два отверстия бором с обратным конусом размера 34, стараясь не повредить мозг. Одно отверстие сделайте перед bregma, а другое — перед lambda, слева от средней линии при кондиционировании правого глаза, или наоборот.

Эти отверстия следует просверливать осторожно, чтобы они соответствовали размеру винтов, прилагая максимальные усилия, чтобы не повредить мозг. В отверстия вставьте винты для электрических соединений. Каждый полный оборот заглубляет винт на 0.28 миллиметров, поэтому достаточно двух полных оборотов.

Затем сделайте на черепе несколько небольших углублений, чтобы увеличить площадь поверхности для сцепления с цементом. На готовом головном устройстве обмотайте заземляющий провод вокруг двух винтов в форме восьмерки. Оставьте некоторый запас заземляющего провода, чтобы головное устройство можно было правильно расположить.

Теперь нанесите холодный лютирующий цемент. Обильно смажьте череп и винты и дайте цементу высохнуть. После высыхания цемента установите головную часть вертикально так, чтобы штифты были направлены вверх над черепом.

Закрепите оголовье с помощью держателя, прикрепленного к кронштейну рамы. Держатель должен иметь пять позолоченных гнезд для фиксации штырьков оголовья. Расположите два ЭМГ-электрода на круговой мышце глаза (muscularis orbicularis oculi) над глазницей.

Затем установите два стимулирующих провода. Разместите зачищенные концы под кожей на расстоянии двух-четырех миллиметров непосредственно каудальнее глаза. Следите за тем, чтобы их концы не соприкасались друг с другом.

Если провода слишком длинные и могут поцарапать глаз животного, укоротите их или отогните. Часть оголенного провода должна оставаться открытой. Теперь зафиксируйте основание проводов на черепе, добавив немного лютингового цемента, и дайте ему высохнуть.

Используйте примерно половину ранее применявшегося объема. Для продолжения удалите микрозажимы и переместите кожу. Дайте коже уложиться естественным образом, чтобы предотвратить натяжение, которое могло бы деформировать веко, препятствовать морганию и, таким образом, испортить эксперимент.

После того как кожа примет нужное положение, снимите держатель головного закрепителя и загерметизируйте открытый участок стоматологическим цементом. Избегайте попадания цемента на глаза или на штифты закрепителя. Затем с помощью ватной палочки, смоченной в растворителе для стоматологического цемента, разгладьте и при необходимости подкорректируйте частично затвердевший цемент.

После полного высыхания цемента извлеките животное из стереотаксической рамы и дайте ему прийти в себя на теплой поверхности, прежде чем вернуть его в домашнюю клетку. Начните привыкание мышей после того, как пройдет не менее пяти дней периода восстановления. Чтобы зафиксировать мышь, осторожно придержите ее за хвост и зафиксируйте в области заплечий.

Затем приподнимите мышь за область живота и туловища. Далее прикрепите коннектор к головному зажиму и затяните стопорный винт. После этого аккуратно поместите мышь на цилиндр и удерживайте её неподвижно, зафиксировав коннектор двумя винтами к перекладинам над цилиндром.

Затем выпустите мышь. В течение первых двух сеансов дайте мыши привыкнуть к цилиндру в течение того же времени, что и длится сеанс кондиционирования. Во время привыкания фиксируйте частоту спонтанного моргания.

Также проведите предварительное приучение мышей к вибрационному стимулятору вибриссов без подачи электрической стимуляции. Разместив пьезосистему рядом с кондиционированной стороной, заведите зубцы гребенки на отдельные вибриссы. Для каждой сессии выбирайте одни и те же вибриссы.

Затем приступают к обучению классическому обусловливанию в соответствии с описанием в тексте. Самцов мышей линии C57 Black 6J в возрасте от восьми до десяти недель обучали условному рефлексу мигания с временным интервалом (trace eyeblink conditioning) в цилиндрическом беговом колесе с фиксацией головы. Для каждой попытки регистрировались данные ЭМГ.

Сигналы ЭМГ были выпрямлены и интегрированы с постоянной времени 10 миллисекунд, затем было рассчитано среднее значение по всем испытаниям. Динамика условных ответов в течение 10 тренировочных сессий показывает, что постепенно амплитуда ответа увеличивалась, а латентный период ответа сокращался. Такая динамика не наблюдается в ответах псевдообученных мышей, которым стимулы предъявлялись в случайном порядке.

Эволюция точно выверенных по времени и, следовательно, хорошо усвоенных условных реакций также может быть прослежена по гистограммам времени до достижения пика ответа после начала подачи सीएस. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготовить затылочный фиксатор, хирургически имплантировать его мыши и поместить мышь на цилиндрическую беговую дорожку для проведения процедуры формирования условного рефлекса мигания с фиксацией головы. По мере освоения условного рефлекса у ваших мышей должна наблюдаться выраженная кривая обучения в течение нескольких дней.

После освоения эта методика может быть выполнена за один час при условии правильного проведения. При выполнении данной процедуры важно сохранять бдительность и следить за любыми признаками дискомфорта у животных. Следует предпринять соответствующие меры для минимизации стресса у животных.