Культивирование и дифференцировка эмбриональных стволовых клеток

Эмбриональные стволовые клетки, или ES-клетки, обладают рядом уникальных свойств, которые отличают их от обычных взрослых клеток. Поэтому ученые разработали специальные методы культивирования для поддержания или использования этих свойств. При правильном культивировании ES-клетки могут делиться бесконечно, чтобы производить больше себя. В то же время, изменяя условия культивирования, ЭС-клетки могут быть направлены на дифференцировку практически в любой тип клеток, обнаруженных в нашем организме; Эта способность ЭС-клеток называется «плюрипотентностью».

В этом видео вы узнаете, как культивировать и пассажировать ES-клетки, чтобы они сохраняли свои уникальные свойства, как индуцировать дифференцировку в ES-клетках для формирования определенных типов клеток, а также о том, как методы культивирования и дифференцировки ES-клеток используются и совершенствуются исследователями сегодня.

Прежде чем углубляться в детали процедур поддержания ЭС-клеток, важно сначала понять, что предотвращает или стимулирует дифференцировку ЭС-клеток. Для того, чтобы ЭС-клетки сохранили свои уникальные свойства плюрипотентности и самообновления, они должны культивироваться со специфическими факторами в питательной среде, которые подавляют спонтанную дифференцировку.

Чаще всего это делается путем культивирования ЭС-клеток на слое «питателей», обычно эмбриональных фибробластов мыши, или МЭФ. Фидерные клетки «питают» ЭС-клетки определенными факторами, такими как активин А, которые помогают поддерживать ЭС-клетки в их недифференцированном состоянии.

В последнее время ученые также разработали методы культивирования без питательных веществ, при которых ES-клетки выращиваются в средах с добавлением необходимых факторов в определенный рецепт. Такой подход снижает вариабельность и удаляет нечеловеческий компонент из клеточных культур ES, что является предпосылкой для клинического применения.

Еще одной характеристикой ЭС-клеток является то, что они естественным образом растут кластерами или колониями и, как правило, имеют низкую выживаемость при диссоциации на отдельные клетки, особенно человеческие ЭС-клетки. В результате, пассирование человеческих ES-клеток обычно требует их удержания в неповрежденных сгустках с помощью механического «ковыряния».

Когда ЭС-клетки выращиваются в неадгезивных условиях, они образуют трехмерные агрегаты, известные как эмбриоидные тельца, или ЭБ, в которых ЭС-клетки дифференцируются во все различные типы клеток. Варьируя условия дифференцировки, такие как добавление специфических факторов роста в среду, ученые разрабатывают методы дифференцировки ES-клеток в определенные типы клеток.

Теперь, когда вы понимаете принципы, лежащие в основе поддержания и дифференцировки ES-клеток, давайте рассмотрим, как культивировать и пассажировать ES-клетки на питателях MEF.

MEF получают из эмбрионов мышей на ранних стадиях, а затем инактивируют химическими веществами или радиацией, чтобы предотвратить их дальнейшее деление. Инактивированные MEF следует наносить на желатинизированные чашки для культивирования тканей по крайней мере за один день до начала культивирования ES-клеток. Когда кормушки полностью устоялись, клетки ЭС размораживаются и высеваются на пластины.

В течение следующих нескольких дней ЭС-клетки вырастут в большие колонии. Прежде чем колонии начнут соприкасаться и срастаться, ЭС культуру следует пропустить. Следует наблюдать за морфологией ES-клеток, чтобы увидеть, проявляют ли они признаки дифференцировки. Недифференцированные колонии ES обычно выглядят четко очерченными и однородными, в то время как дифференцированные клетки будут выглядеть как тусклые «булыжники» неправильной формы.

Если колонии демонстрируют 70% или более дифференцировки или если они разрежены, механически вырежьте недифференцированные колонии и перенесите их на новую кормушку. В противном случае просто удалите дифференцированные участки или колонии и приступайте к пассированию.

После того, как дифференцированные колонии были очищены, добавляются протеолитические ферменты, такие как коллагеназа, чтобы поднять клетки из планшета с инкубацией при 37°C в течение соответствующего периода времени. Затем добавляется свежая среда ES, чтобы остановить ферментативные реакции. Колонии механически вытесняются из планшета и переносятся в центрифужную пробирку, где они разбиваются на нужные размеры с помощью щадящего пипетирования. Элементы ES собираются центрифугированием, ресуспендируются в среде ES и наносятся на подготовленные подающие пластины.

После того, как мы узнали, как проходить через ES-клетки, давайте рассмотрим один из наиболее распространенных методов, используемых для дифференцировки ES-клеток в эмбриоидные тельца — метод висячей капли.

Для начала ЭС-клетки отделяются с помощью протеолитических ферментов, таких как коллагеназа, и разводятся до желаемой концентрации в средах, содержащих факторы дифференцировки, специфичные для линии. Затем суспензия ES-клеток капляется на крышку бактериальной чашки Петри. Крышка быстро переворачивается и ставится на блюдо, поэтому капли медиа будут висеть вниз головой и позволят развиваться эмбриоидным телам.

Примерно через два дня капли с БЭ можно собирать и наносить на неадгезивные пластины для дальнейшего культивирования. В подходящий для желаемой клеточной линии момент времени эмбриоидные тельца помещаются обратно на желатинизированные адгезивные чашки для культуры тканей для дальнейшей дифференцировки.

Теперь, когда мы рассмотрели основные методы культивирования и дифференцировки ES-клеток, давайте рассмотрим, как они адаптированы к конкретным экспериментальным потребностям.

Как упоминалось ранее, ЭС-клетки могут быть направлены на дифференцировку в определенные типы клеток при различных условиях культивирования. В этом эксперименте ученые получили моторные нейроны из ЭС-клеток человека. Это было сделано путем добавления факторов к дифференцировке эмбриоидных тел, которые направляют их к нейронной линии, а затем химических веществ и условий покрытия, которые превращают эти клетки в моторные нейроны. Используя аналогичные подходы, исследователи добились успеха в дифференцировке ЭС-клеток в ритмично бьющиеся клетки сердечной мышцы.

Поскольку дифференцировочные ES-клетки имитируют события, происходящие при естественном развитии эмбрионов, мы также можем использовать их для исследования биологии раннего эмбрионального развития. Одним из изучаемых явлений является инактивация Х-хромосомы, или XCI, важнейший процесс, при котором одна из двух Х-хромосом подавляется в каждой клетке самки млекопитающего. Визуализируя распределение специфических РНК и белков в развивающихся БЭ, ученые получили ценную информацию о биологии XCI.

Наконец, чтобы повысить согласованность и эффективность экспериментов с ES-клетками, ученые постоянно пытаются разработать более совершенные методы культивирования ES-клеток. Один из подходов заключается в выращивании ES-клеток в одном слое, что называется монослойным культивированием неколонийного типа, или NCM.

Помните, что человеческие ЭС-клетки, как правило, несчастны, когда они не растут как 3D-агрегаты? Ученые показали, что химические вещества, известные как ингибиторы ROCK, увеличивают выживаемость диссоциированных ES-клеток, что позволяет им проходить в виде одиночных клеточных суспензий и покрываться с высокой плотностью. Преимущество метода NCM заключается в том, что каждая клетка будет в большей степени подвергаться воздействию факторов роста и питательных веществ в среде, снижая гетерогенность внутри культуры и облегчая выращивание ES-клеток в больших количествах.

Вы только что посмотрели видео JoVE о том, как культивировать и дифференцировать эмбриональные стволовые клетки. Теперь вы должны знать, какие факторы важны для поддержания ЭС-клеток в их недифференцированном состоянии, и как мы можем использовать плюрипотентность ЭС-клеток для создания определенных типов клеток в чашке. В дальнейшем ученые будут работать над разработкой более эффективных и четко определенных условий культивирования и дифференцировки для получения специализированных типов клеток, которые могут быть использованы в приложениях регенеративной медицины. Спасибо за просмотр!