2.9: Индуцированная плюрипотентность

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, как и человеческие эмбриональные стволовые клетки, могут дифференцироваться практически в любую клетку организма и поэтому имеют большие перспективы в области регенеративной медицины.

Человеческие эмбриональные стволовые клетки, или hESCs, получают из предимплантационных эмбрионов, в то время как полностью дифференцированные соматические клетки используются для создания индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, которые также называются iPSCs.

В этом видео вы узнаете об основных принципах создания иПСК, пошаговом протоколе индуцирования плюрипотентности в дифференцированных клетках, а также о некоторых из многих последующих применений и модификаций этого протокола.

Давайте начнем с обсуждения принципов, лежащих в основе генерации ИПСК из соматических типов клеток.

Дифференцированные клетки, такие как клетки кожи или нейроны, являются теми, чья судьба решается. Они обязуются выполнять определенную функцию. С другой стороны, плюрипотентные стволовые клетки – это те, судьба которых не решена, и они могут дифференцироваться в любой тип клеток.

Процесс изменения идентичности уже дифференцированной клетки в плюрипотентное состояние называется клеточным перепрограммированием. Это включает в себя изменение паттерна экспрессии генов в клетке, потому что количество и типы белков, производимых клеткой, играют важную роль в определении идентичности клетки.

Одним из способов индуцирования клеточного перепрограммирования является индуцирование экспрессии определенных факторов транскрипции. Факторы транскрипции — это белки, которые связываются с регуляторными последовательностями в гене. Некоторые из этих последовательностей называются «промоторами» и, следовательно, способствуют транскрипции гена. Несколько факторов транскрипции могут влиять на экспрессию многочисленных генов, что оказывает огромное влияние на идентичность клеток.

Четыре классических фактора транскрипции, которые, как было продемонстрировано, индуцируют плюрипотентность, — это Oct4, Sox2, cMyc и Klf4. Эти факторы также известны как факторы Яманаки, по имени исследователя, который обнаружил их эффекты перепрограммирования.

Для индуцирования экспрессии этих факторов транскрипции можно использовать несколько методов. Наиболее распространенным и эффективным методом является использование модифицированного вируса для доставки генов транскрипционного фактора в ядро, где они интегрируются в геном.

В этом методе гены, кодирующие четыре фактора Яманаки, индивидуально упаковываются в различные ретровирусы и добавляются к дифференцированным клеткам. Когда клетки подвергаются воздействию модифицированных вирусов, небольшая часть дифференцированных клеток заражается всеми четырьмя вирусами, несущими транскрипционный фактор. Они начинают дедифференцироваться до тех пор, пока не образуются большие сферические кластеры плюрипотентных стволовых клеток. Формирование кластера помогает ИПСК создавать микроокружение, аналогичное стволовым клеткам in vivo, и, следовательно, помогает им поддерживать их плюрипотентность.

Теперь, когда вы понимаете основные принципы создания ИПСК, давайте рассмотрим общий протокол индуцирования плюрипотентности в эмбриональных фибробластах мыши, или МЭФ, с помощью системы вирусной трансдукции.

Прежде чем начать эту процедуру, обратите внимание, что вирусы могут инфицировать клетки вашего организма, поэтому соблюдение правил безопасности чрезвычайно важно.

Чтобы начать процесс трансфекции, питательную среду удаляют из планшета, содержащего МЭФ высокой плотности, и промывают клетки буферным раствором. Затем добавляется раствор, содержащий фермент, разрушающий белки, такой как трипсин, чтобы поднять клетки со дна чашки. Затем в планшет добавляют питательную среду, а отделенные клетки переносят в центрифужную пробирку.

После центрифугирования гранула повторно суспендируется в питательной среде. Затем клетки подсчитываются и концентрация корректируется таким образом, чтобы на следующий день вирусом можно было заразить оптимальное количество клеток. Инкубируйте клетки на ночь.

После того, как клетки приживаются на своей новой тарелке, старая среда заменяется свежей, а сконструированные вирусы, содержащие желаемые факторы транскрипции, добавляются в пластину. Затем клетки инкубируются с вирусами в течение достаточного времени, чтобы позволить инфекции произойти. После инкубации среда, содержащая свободные вирусы, удаляется и заменяется свежей средой эмбриональных стволовых клеток.

В течение 2-3 недель после трансформации клетки следует выращивать при температуре 37° в инкубаторе, а питательные среды следует заменять ежедневно.

По истечении этого периода времени колонии iPSC, которые внешне похожи на колонии эмбриональных стволовых клеток, должны стать достаточно большими, чтобы их можно было обнаружить. Колонии можно пересадить в свежую тарелку, содержащую среду с соответствующими факторами роста, и позволить им расти дальше. Чтобы подтвердить плюрипотентность, часть клеточной популяции окрашивают маркерами плюрипотентности.

Теперь, когда вы узнали, как получить ИПСК из дифференцированных клеток, давайте рассмотрим некоторые последующие приложения и модификации этого очень полезного метода.

Важной особенностью ИПСК является то, что с их помощью можно получить практически любую клетку организма. В этом примере показано образование клеток сердечной мышцы, называемых кардиомиоцитами, из иПСК. Для этого ИПСК переносят на неадгезивные пластины, что позволяет им образовывать эмбриоидные тельца, представляющие собой агрегаты плюрипотентных стволовых клеток. Эмбриоидные тельца культивируют в специализированной среде, содержащей сыворотку и аскорбиновую кислоту, которая усиливает сердечную дифференцировку. Успешную дифференцировку можно легко наблюдать, когда некоторые клетки начинают биться.

Поскольку ИПСК потенциально могут дифференцироваться в любой тип клеток, они также могут образовывать целый организм, подобно мыши. Это можно сделать с помощью анализа, называемого тетраплоидной комплементацией. Во-первых, тетраплоидный эмбрион, эмбрион, содержащий четыре набора хромосом, формируется путем слияния двух клеток раннего эмбриона вместе с помощью электрического поля. Тетраплоидному эмбриону дают развиться до стадии бластоцисты. Затем iPSCs вводятся в бластоцисту, которая затем трансплантируется женщине-реципиенту для супоросности. Тетраплоидные клетки способны образовывать только экстраэмбриональные структуры, такие как плацента, поэтому животные, полученные в результате этого метода, полностью получают из ИПСК.

Некоторые исследователи модифицируют процедуру перепрограммирования, чтобы сделать процесс идентификации успешно перепрограммированных клеток более эффективным. Например, в этом эксперименте MEF, обладающие способностью экспрессировать зеленый флуоресцентный белок под влиянием промотора Oct4, помогли исследователям легко идентифицировать клетки, приобретшие плюрипотентность.

Вы только что посмотрели видео JoVE о генерации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. В этом видео были рассмотрены принципы, лежащие в основе этой процедуры, а также пошаговый протокол получения ИПСК из дифференцированных клеток. Мы также рассмотрели, как этот метод может быть применен или модифицирован для лабораторных экспериментов.

Открытие ИПСК оказало огромное влияние на область биологии стволовых клеток, поскольку оно обладает огромным потенциалом для разработки методов лечения, которые могут быть использованы для лечения дегенеративных заболеваний. Несмотря на то, что в области ИПСК был достигнут значительный прогресс, препятствие, которое все еще необходимо преодолеть, является связанный с этим риск развития рака. Существующие процедуры перепрограммирования могут привести к нерегулируемому росту клеток, что может привести к раку. Таким образом, необходимы дополнительные исследования для фактического использования ИПСК в клинической практике. Как всегда, спасибо за просмотр!