Многофункциональный, Микропипетки основе метода для регистрации и стимуляции бактериального механочувствительных ионных каналов в капельной интерфейса Бислои

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы функционально воссоздать мескальные каналы в капельный интерфейс, двухслойную систему, а также изучить реакцию этих механически чувствительных каналов на гармонические механические стимулы. Этот метод позволяет изучать механическую электрическую активность мутанта мескаля V 23 T в ответ на гармоническое механическое возбуждение после перестроения в границу раздела капель по системе слоев. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он использует технические преимущества как метода патч-зажима, так и капельного интерфейса послойными методами с возможностью миниатюризации, а также возможностью контроля химического состава каждой стороны мембраны.

Чтобы составить рецептуру липосом, приготовьте 10 миллилитров липидного раствора с концентрацией два миллиграмма на миллилитр, добавив 10 миллилитров буфера хлорида калия к 20 миллиграммам синтетических липидов D-P-H-P-C, приобретенных в виде лиофилизированного порошка. Убедитесь, что липидные носители и буферный раствор тщательно перемешаны. Смесь должна выглядеть однородной и туманной, когда все растворится.

Заморозьте смесь при температуре минус 20 градусов Цельсия, теперь полностью разморозьте новую липидную смесь, дав смеси оттаять при комнатной температуре, а не в нагретой среде. После шести циклов замораживания и оттаивания используйте коммерчески доступный экструдер для выдавливания липидов, продавливая всю липидную суспензию сначала через мембранный фильтр из поликарбоната толщиной 0,4 микрона, а затем шесть раз через мембранный фильтр толщиной 0,1 микрона. В результате этого процесса получаются частицы диаметром около 100 нанометров.

Чтобы изготовить масляный резервуар, просверлите два противоположных отверстия в стенке акрилового цилиндра диаметром два дюйма и длиной 1,5 сантиметра. Отверстия должны быть диаметром один миллиметр и один сантиметр от дна. Затем просверлите два четырехмиллиметровых отверстия, концентричных по отношению к ранее просверленным отверстиям в один миллиметр.

Глубина отверстий должна составлять по одному миллиметру. Будьте осторожны, чтобы не просверлить их полностью. Эти отверстия сделаны под резиновые прокладки.

Поместите и приклейте две резиновые прокладки с внутренним диаметром в один миллиметр в большие отверстия, чтобы предотвратить утечку масла. Затем приклейте машинку к цилиндру к тонкому акриловому листу размером 10 сантиметров на 10 сантиметров с помощью любой многоцелевой эпоксидной смолы в день проведения эксперимента, вырежьте семисантиметровые отрезки диаметром 2 250 микрон, а затем погрузите их кончики в хлорную известь на два часа. Для образования покрытия из хлорида серебра серый цвет указывает на то, что образовалось покрытие из хлорида серебра.

С помощью стеклореза расщепляют 10-сантиметровый капилляр из силикатного стекла длиной 10 сантиметров с внешним диаметром один миллиметр и точкой 58 миллиметровым внутренним диаметром на два пятисантиметровых капилляра. С помощью одномиллилитрового шприца с тупым наконечником иглы 18 калибра заполните капилляры гидрогелем P-E-G-D-M-A, чтобы предотвратить набухание гидратированного гидрогеля из капилляра. Соблюдайте трехмиллиметровый зазор на кончиках и следите за тем, чтобы в капиллярах не было пузырьков воздуха.

Вставьте электроды из серебра, хлорида серебра в заполненные гидрогелем капилляры. Отверждение гидрогеля P-E-G-D-M-A путем фотополимеризации свободными радикалами при воздействии ультрафиолетового света в течение двух минут при одном ватте с использованием ультрафиолетового пятна, эксперимент проводится под клеткой Фарадея, заземленной на заземление на патч-усилителе. Прикрепите одну из микропипеток к прямому держателю микроэлектродов с наружным разъемом.

Затем подключите держатель микроэлектродов к головному столу патч-усилителя. Чтобы подключить головной столик к земле, припаяйте изолированный медный провод 18 калибра к соответствующему разъему для головного столика, установите головной столик на трехосевой ручной микроманипулятор, сначала прикрепив монтажную пластину головного столика к микроманипулятору, а затем подключив головной столик к монтажной пластине. С помощью соответствующих винтов прикрепите вторую микропипетку к линейному приводу через изготовленный в лаборатории разъем, а затем установите обе на второй микрометровый манипулятор.

Микропипетки должны быть расположены друг против друга, выровнены и горизонтально выровнены. Далее в стеклянном флаконе смешайте 0,1 миллилитра липосом D-P-H-P-C с 0,01 миллилитром раствора липосомы мескаля V 23 Тл. С помощью иглы для микронаполнения 34 калибра заполните кончики обеих микропипеток раствором протеосомы.

Поместите резервуар в верхнюю часть вертикального микроскопа и подайте микропипетки через противоположные отверстия диаметром в один миллиметр. Затем заполните резервуар до поверхности шестигранным деканом, чтобы образовались сферические капли на кончиках микропипеток. Используйте третью микропипетку диаметром 10 микрон из силикатного стекла, установленную на манипуляторе третьего микрометра, чтобы распределить разбавленный раствор липосомы V 23 T мескаль протеи на кончиках микропипеток и сформировать капли.

Контролируйте размер капель, уменьшая или увеличивая объем по желанию, и дайте им отдохнуть в течение 10 минут, чтобы монослои полностью сформировались. Затем послойно соприкоснитесь с каплями. Формирование произойдет в течение одной-двух минут.

После настройки программного обеспечения и оборудования, как описано в текстовом протоколе, используйте кабель BNC для подключения выхода генератора сигналов к внешнему переднему переключателю ввода команд. Отправьте треугольную сигнал с частотой 10 герц и 500 милливольт на верхнюю часть сцены. С помощью микром манипулятора.

Переместите стеклянные микропипетки горизонтально, чтобы капли соприкоснулись, пока они слегка соприкоснутся, и подождите, пока произойдет истончение бислоя. Прогресс процесса формирования бислоя можно увидеть визуально через микроскоп и отслеживать с помощью текущих измерений. Отрегулируйте размер бислоя примерно до 250 микрон в диаметре, контролируя положение капли, установленной на приводе с помощью манипулятора, размер бислоя можно оценить визуально через микроскоп.

После того, как бислой сформировался и стабилен, стимулируйте капли, посылая синусоидальный сигнал с помощью функционального генератора для стимуляции белка мескаля, включенного в бислой. Отправка синусоидальной формы сигнала с амплитудой от размаха до пика 175 мкм, частотой 0,2 герца и коэффициентом заполнения 50% на контроллер электрического сервера Pieto. Здесь показана нетипичная запись тока в реальном времени.

Измеренная емкость бислоя внезапно увеличивается, указывая на истончение и формирование бислоя до того, как он достигнет устойчивого состояния. Бислой можно контролировать, изменяя положение капель при механической стимуляции DIB при сохранении постоянного потенциала по всей мембране. Мутант V 23 T мескаля генерирует надежную активность, включающую в основном субпроводящие состояния и иногда полное открытие.

Стробирование происходит в основном при пиковом сжатии, что указывает на то, что оно связано с увеличением натяжения бислоя, как показано на полярном графике. Здесь подчеркивается возможность использования этого метода для тестирования других типов биомолекул. Этин, представляющий собой потенциальный ионный канал, увеличивает проницаемость мембраны при приложении трансмембранного потенциала постоянного тока One master.

Эту технику можно выполнить за два часа, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что нельзя случайно не повредить стеклянные капилляры или как-то иначе. Вам нужно перезапустить настройку и убедиться, что все провода подключены после ее разработки.

Этот метод проложил путь исследователям в области растяжения, активируемых каналами, к изучению новых методов, с помощью которых внешние силы могут быть переданы к воротам чувствительных каналов встроенного механизма DIB. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как формировать соприкосновение капель слоями, встраивать в искусственные мембраны механически чувствительные каналы и механически стимулировать эти каналы.