Бактериальный лист инфильтрация Анализ на тонкой Характеристика защитных реакций растений с помощью

Общая цель данной процедуры заключается в количественной характеристике иммунного ответа Arabidopsis diliana с помощью оптимизированного метода шприцевой инфильтрации. Сначала с помощью шприцевой инфильтрации бактерии вводятся вручную в лист через естественные отверстия, называемые устьицами. На втором этапе после развития симптомов заболевания вырезают диски из инфицированной ткани листа.

Затем бактерии извлекают из дисков листьев путем высокопроизводительной гомогенизации. Заключительным этапом являются последовательное разведение и посев на чашки для подсчета бактерий с целью определения количества колоний. В конечном итоге рост бактерий в каждом диске листа может быть соотнесен с относительной силой иммунного ответа растения.

Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области иммунитета растений, такие как идентификация генов, участвующих в защитных реакциях на биотический стресс. Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами является возможность точного количественного определения роста патогена в инфицированной ткани растения, что позволяет избежать экспериментальных ошибок, вызванных отбором листьев на разных стадиях развития. Этот метод позволяет получить представление об иммунном ответе растения на инфекцию вирулентным бактериальным патогеном, а также может быть применен к другим системам, таким как иммунные ответы, инициируемые салициловой кислотой или микробоассоциированными молекулярными паттернами.

Как правило, лицам, впервые применяющим данный метод, бывает сложно ввести бактерии в лист, не повредив ткани. Следующую процедуру продемонстрируют постдок Hindu, а также аспиранты shalu и yali Soon из моей лаборатории. В данном видео будет продемонстрирован анализ повышенной восприимчивости к заболеванию.

Перед началом эксперимента подготовьте чашки с питательной средой Кинга B (KB). Приготовьте один литр твердой среды KB согласно описанию в тексте протокола и дайте ей остыть на магнитной мешалке. Когда среда станет едва теплой на ощупь, добавьте в неё 80% глицерин, 1 M сульфат магния и стрептомицин, затем разлейте среду по чашкам двух разных размеров. Петри меньшего размера используется в качестве основной чашки для культивирования бактерий, а Петри большего размера — для подсчета бактерий.

Храните чашки при температуре 4 °C за два дня до посева для анализа. PSM ES 43 26. Бактерии из глицериновой стоковой культуры, хранившейся при -80 °C, высейте на чашку с культуральной средой KB strep и инкубируйте при 28 °C от 24 до 48 часов на следующий день.

Начните приготовление жидкой культуры в стерильной пробирке, используя 4 мл жидкой среды KB, содержащей 50 мкг/мл стрептомицина. Инкубируйте при перемешивании со скоростью 250 об/мин при температуре 28 °C в течение ночи. Растения Arabidopsis для эксперимента выращивают в условиях, подробно описанных в тексте протокола, в тот же день, когда начинается подготовка жидкой бактериальной культуры.

Пометьте лепестки листьев номер пять и шесть тупым водостойким маркером для облегчения идентификации инфицированных тканей при отборе проб. Чтобы улучшить раскрытие устьиц и облегчить проникновение раствора патогена в ткани листа, хорошо пропитайте растения, погрузив горшок в воду дном на 20 минут.

Через 20 минут слейте излишки воды. Инфицирование растений Arabidopsis проводится на следующий день после постановки жидкой культуры.

Перенесите бактериальную культуру в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 9 600 G в течение двух минут. При комнатной температуре удалите супернатант и ресуспендируйте бактериальный осадок в одном миллилитре стерильного 10 мМ раствора хлорида магния; разбавьте бактериальную суспензию девятью миллилитрами 10 мМ раствора хлорида магния в центрифужной пробирке объемом 50 мл. После измерения оптической плотности бактерий разбавьте их 10 мМ раствором хлорида магния до конечного значения OD 600, равного 0,0002.

Для проведения анализа инфицирования EDS. Для инфильтрации используется одномиллилитровый шприц без иглы с тупым концом, широко известный как инсулиновый шприц. Заполните шприц от 0,5 до 0,6 миллилитра разведенного бактериального раствора для более точного контроля в процессе инфильтрации; не заполняйте шприц до полного объема.

Поместите нижнюю сторону листа на кончик указательного пальца, затем с помощью большого пальца аккуратно отрегулируйте положение листа. Держите шприц вертикально по отношению к поверхности листа, чтобы обеспечить равномерное распределение давления и минимизировать повреждение ткани. При проведении инфильтрации старайтесь избегать области центральной жилки.

Медленно нажмите на plunger, чтобы ввести бактериальный раствор. Проникновение жидкости в мезофилл листа будет заметно по потемнению ткани листа; проведите инфильтрацию всей поверхности листа, даже если для этого потребуется несколько попыток. После завершения инфильтрации аккуратно промокните лист абсорбирующей салфеткой, чтобы удалить излишки раствора патогена.

Визуально осмотрите ткани инфицированного листа на наличие повреждений. Оставьте инфильтрированные растения подсыхать от одного до двух часов, затем верните растения в исходные условия выращивания. Опрыскайте прозрачный колпак водой и накройте им инфицированные растения на два часа.

Затем приоткройте купол, создав отверстие диаметром от двух до трех дюймов, и оставьте его в таком положении на протяжении всего остального времени эксперимента по инфицированию, который обычно длится три дня. За один день до количественного определения роста патогена предварительно высушите чашки с средой KB размером 150 мм на 15 мм.

Высушите чашки, выдержав их при комнатной температуре около 24 часов. Обработайте инфицированную ткань после появления склероза, о чем свидетельствует пожелтение инфицированной ткани у восприимчивых генотипов, но до развития некротических поражений. Для каждого генотипа подготовьте шесть трубок для растирания.

Поместите один стальной измельчающий шарик и добавьте 500 µL стерильного 10 mM раствора хлорида магния в каждую пробирку. Затем отделите зараженный лист от растения и с помощью пинцета случайным образом вырежьте диски листа одноотверстным дыроколом; поместите по два диска листа от двух разных растений в каждую пробирку для гомогенизации. Герметично закройте пробирки и гомогенизируйте ткань с помощью высокопроизводительного гомогенизатора на максимальной скорости в течение 10 минут.

При необходимости повторяйте этот процесс до тех пор, пока ткань не станет полностью гомогенизированной, а растворы не приобретут зеленый цвет из-за высвобождения хлорофилла из инфицированных листьев во время ожидания. Для гомогенизации заполните каждую лунку в первых шести рядах 96-луночного культурального планшета 180 µL 10 mM хлорида магния. Перенесите 20 µL суспензии измельченной ткани в каждую лунку первого ряда 96-луночного планшета и перемешайте, несколько раз всасывая и вытесняя жидкость пипеткой.

Если кончик дозатора засорился мелкими фрагментами ткани, отсеките два-три миллиметра кончика, чтобы обеспечить забор точного объема раствора. Для создания достаточного пространства для капли на верхней части планшета размещайте ткани разных генотипов в шахматном порядке по рядам. Для приготовления десятикратного серийного разведения перенесите 20 µL суспензии ткани во второй ряд и повторяйте эту процедуру до шестого разведения. С помощью раздельных наконечников дозатора перенесите 20 µL раствора из 96-луночного планшета на чашку КБ размером 150 мм на 15 мм.

Работайте от самого разбавленного суспензии к самой концентрированной, чтобы не приходилось менять наконечники дозатора между разведениями. Высушите планшет при комнатной температуре, приоткрыв крышку. Когда на поверхности планшета больше не будет видно жидкости, закройте крышку, переверните планшет и инкубируйте его при комнатной температуре.

Инкубируйте планшеты от 40 до 60 часов до появления видимых колоний. Подтвердите, что количество бактерий на планшетах соответствует ожидаемому десятикратному снижению количества колониеобразующих единиц.

Подсчитайте бактерии до того, как они избыточно вырастут и колонии сольются. Определите количество бактерий в самом низком разведении, где колонии не перекрывают друг друга. Обычно для подсчета предпочтительным является разведение, содержащее от 10 до 50 колоний; этот показатель может варьироваться между техническими повторами.

Для расчета уровней бактериальной пролиферации определите количество колониеобразующих единиц на один диск листа по следующей формуле, где R — номер ряда, а T — количество бактерий в каждой технической повторности. Затем данные используются для построения графика. Каждая точка данных представлена как среднее значение шести технических повторностей в логарифмическом масштабе.

Планки погрешностей представляют собой 95% доверительный интервал среднего значения выраженности заболевания. Восприимчивость к P-S-M-E-S 43 26 оценивали путем заражения инокулятом с OD 600, равным 0,0002. Результаты показывают, что высокочувствительные мутанты NPR 1-1 имеют примерно на 2,5 log или в 300 раз более интенсивный рост патогена по сравнению с растениями дикого типа Columbia 0.

Метод инфильтрации шприцем можно модифицировать для оценки различных уровней иммунного ответа. Для анализа иммунитета, индуцированного салициловой кислотой, используется наружное нанесение салицилата натрия для запуска иммунного ответа, который количественно оценивается по росту патогена. Отсутствие NPR1, который функционирует как рецептор салициловой кислоты и основной транскрипционный корегулятор зависимых от салициловой кислоты целевых генов, приводит к нечувствительности к экзогенному применению производного салициловой кислоты.

Для характеристики иммунитета, индуцированного молекулярными паттернами, ассоциированными с микробами, растения подвергали предварительной обработке двумя известными триггерами: FLAG 22 и L 18. У растений дикого типа Columbia 0, обработанных FLAG 22, наблюдалось снижение бактериальной популяции на один логарифмический порядок или в 10 раз, в то время как у растений-мутантов FLS2 эффект ограничения роста бактерий не проявился. Аналогично, растения-мутанты EFR оказались нечувствительны к предварительной обработке L 18.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как количественно оценить иммунный ответ Arabic opsys с помощью анализа шприцевой инфильтрации. При выполнении этой процедуры важно не забывать контролировать развитие заболевания и брать пробы ткани после появления corsis. Pseudomona pather cul cola S phos 3, 2 6 является гемиатрофическим патогеном.

Таким образом, отбор проб следует проводить до перехода в нейротрофную стадию. После выполнения этой процедуры можно применить другие методы, такие как количественная ПЦР в реальном времени и вестерн-блот анализ крови, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о том, какой именно путь иммунного сигналинга нарушен. Не забывайте, что вы работаете с живыми бактериями.

Хотя Pseudomona Senge не является патогенной для человека, при выполнении данной процедуры помните о необходимости надлежащей утилизации загрязненных расходных материалов и инфицированных растений.