Метод Lineage Tracing из клетки роговицы, используя Multi-Color Люминесцентная Reporter Мышей

Общая цель этого метода заключается в обнаружении и отслеживании миграции, экспансии и выживания стволовых клеток и клеток-предшественников в эпителии роговицы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии эпителиальных клеток роговицы, касающиеся гомеостаза, восстановления тканей, старения и патологии. Основное преимущество этого метода заключается в том, что его легко установить и он позволяет неинвазивно отслеживать происхождение клеток клональным способом.

Для начала сначала выберите трансгенную линию мышей кри с индуцируемым тканеспецифическим промотором для маркировки лимбальных и роговичных эпителиальных клеток-предшественников и стволовых клеток. Используется линейка Tamoxifen Inducible K 14 Cree ERT. Далее выберите подходящую кассету brainbow в зависимости от исследовательского вопроса и доступной линейки кри.

В этом случае используется линейка Brainbow 2.1. Скрещивание гомозиготного штамма конфетти R 26 R с гомозиготным штаммом K 14 Cree ERT для получения мышей с четырьмя цветными K 14 положительными клетками Для индуцирования рекомбинации у трансгенных мышей. Сначала взвесьте 80 миллиграммов тамоксифена и растворите его в одном миллилитре кукурузного масла методом вортексинга.

Поместите раствор на водяную баню, поддерживаемую при температуре 65 градусов Цельсия до полного растворения, и оставьте его в ванне до следующего использования обезболивания. Восьминедельная мышь Brainbow 2.1 Cree ERT гетерозиготной и проверяет глубину анестезии с помощью щепки пальца ноги осторожно наносит 100 микролитров раствора тамоксифена на каждую глазную поверхность мыши. Прямое применение Тамоксифена дает высокую эффективность индукции Cree Храните любые остатки раствора Тамоксифена защищенным от света при температуре четыре градуса Цельсия на срок до одной недели.

Подогрейте раствор перед применением, которое повторяют три дня подряд для каждой мыши. Сначала растворите один грамм порошка Тамоксифена в пяти миллилитрах стерильного диметилсульфоксида. Чтобы получить раствор в соотношении 200 миллиграмм на миллилитр, установите раствор на водяную баню, поддерживайте его при температуре 65 градусов Цельсия до тех пор, пока он не станет прозрачным и оставьте его в ванне до использования.

Затем обезболите мышь и проверьте глубину анестезии с помощью зажима пальца ноги, нанесите глазную мазь на необработанный глаз мыши, чтобы защитить его от обезвоживания во время процедуры, и введите адекватные анальгетики. Затем наберите 200 микролитров раствора тамоксифена в шприц без прикрепленной иглы и нанесите его местно на всю роговицу глаза. Жидкость застывает на ткани при комнатной температуре.

Следите за мышью до тех пор, пока она не станет лежачей на груди, и возвращайте ее в компанию других только тогда, когда она будет в полном сознании. После жертвоприношения мышей в соответствующие моменты времени после индукции, ранение глаза, как описано в текстовом протоколе. Зародыш глаза, сначала надавив на веко, чтобы вытащить глазное яблоко из глазницы.

Сдвиньте изогнутые щипцы за глазное яблоко, чтобы удержать зрительный нерв, и потяните глазное яблоко вверх, чтобы отсоединить его. Поместите каждое глазное яблоко в 60-миллиметровую посуду, содержащую PBS. Поместите пластину, содержащую глаз, под хирургический стереомикроскоп.

Убедитесь, что вы распознаете основную структуру глаза, роговицы, лимба и зрительного нерва. Удалите зрительный нерв, мышцу и соединительную ткань вокруг глаза. Держите глаз в задней части роговицей вниз и сделайте разрез в склере в задней части глазного яблока с помощью пружинных ножниц.

Увеличьте разрез, чтобы хрусталик мог выскочить, и удалите радужную оболочку щипцами. Затем сделайте четыре-пять радиальных разрезов, разрезая от центра к периферии, чтобы сделать роговицу плоской, а затем удалите все оставшиеся участки радужной оболочки с помощью тонкого плоского шпателя. Наконец, разрежьте лишнюю периферическую ткань, окружающую лимб, чтобы зафиксировать роговицу.

Переложите рассеченную ткань в чашку на 12 лунок и инкубируйте ее в 4%-ной части формальдегида в течение 10 минут. Затем кратковременно промойте ткань в PBS, чтобы окрасить ядра клеток. Инкубируйте роговицу в двух микрограммах на миллилитр раствора DPI в течение 10 минут, после чего кратковременно промойте в PBS.

Далее поместите роговицу на предметное стекло эпителиальной стороной вверх. Затем поместите каплю монтажного носителя поверх роговицы и накройте ее покровным листом. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи при комнатной температуре и храните их при температуре четыре градуса Цельсия.

Для визуализации роговицы используйте спектральную конфокальную систему, которая позволяет разделить излучения R-F-P-Y-F-P-P-G-F-P и CFP. Сначала установите длины волн флуоресценции, возбуждения и излучения в зависимости от флуоресцентных белков мозга. Bo кассета, заботящаяся о предотвращении перекрестного возбуждения или наложения эмиссионных сигналов.

Затем получите мозаичные изображения, чтобы визуализировать всю роговицу в высоком разрешении. Здесь мы получим массив изображений 12 на 12 во всех четырех флуоресцентных каналах. Наконец, объедините изображения, чтобы создать составную родословную.

Были проведены эксперименты по отслеживанию с использованием мышей с конфетти R 26 R, чтобы проследить за судьбой клеток-предшественников лимбального и роговичного эпителия. В стационарных условиях небольшие кластеры флуоресцентных клеток наблюдались через 10 дней после индукции, как и ожидалось. Через четыре месяца развились полосы от лимба к центру роговицы, что позволяет предположить, что клетки мигрируют из лимба для регенерации роговицы после повреждения роговицы.

Миграция со стороны лимба происходила быстро, с длинными, толстыми лимбальными полосами, развивающимися в течение семи дней. Эта модель ценна для отслеживания и изучения стволовых и прогениторных клеток роговицы в различных условиях. Это позволит исследовать экспансию, выживание и миграцию клональных клеток в стационарном состоянии и в стрессовых условиях, таких как ранения, мутация химического ожога и многое другое.

Эта модель также может быть использована для анализа молекулярных механизмов, лежащих в основе нормальной и патологической регенерации роговицы. Этот метод может способствовать нашему пониманию различных патологических состояний, таких как дистрофии роговицы, ожоги и травмы роговицы, а также оценке влияния различных методов лечения на регенерацию роговицы, экспансию и миграцию клеток.