Количественная оценка продолжительности жизни беспозвоночных
Многие животные естественным образом прекращают рост по достижении взрослого возраста, после чего претерпевают старение или «старение» вплоть до смерт…
Эксперименты по количественной оценке продолжительности жизни позволяют ученым изучить влияние генетики и окружающей среды на продолжительность жизни организма. Беспозвоночные модельные организмы, такие как плодовая муха Drosophila melanogaster и круглый червь Caenorhabditis elegans, оказались чрезвычайно полезными в этом отношении. Проводя эксперименты, которые измеряют и манипулируют продолжительностью жизни этих организмов, ученые начали выяснять факторы, влияющие на процесс старения.
В этом видео вы узнаете о некоторых принципах, лежащих в основе определения продолжительности жизни и старения, об основных протоколах измерения продолжительности жизни червя и плодовой мушки, а также о способах применения этих экспериментов.
Прежде чем рассматривать экспериментальные процедуры для измерения продолжительности жизни, важно сначала понять, что такое продолжительность жизни и старение.
Продолжительность жизни — это количество времени, в течение которого организм живет и функционирует между рождением и смертью. Некоторые организмы, как и многие растения, теоретически могут жить вечно. Между тем, большинство животных естественным образом перестают расти, даже в идеальных условиях, после чего они стареют или «стареют» до самой смерти.
Ученые до сих пор до конца не понимают, почему организмы стареют. Различные факторы, в том числе радиационный и химический ущерб от окружающей среды, а также токсичные побочные продукты наших собственных метаболических процессов, играют роль в старении.
Чтобы изучить эти факторы, исследователи использовали короткое время генерации беспозвоночных модельных организмов, таких как черви и мухи, что позволяет ученым наблюдать за несколькими поколениями в течение нескольких дней или недель, а не месяцев, как в случае с моделями млекопитающих, таких как мыши. Они также вполне поддаются генетическим манипуляциям, с помощью многих доступных инструментов, которые позволяют легко включать или выключать определенные гены, чтобы наблюдать за их влиянием на процесс старения.
Теперь, когда мы узнали, почему модели беспозвоночных так хорошо поддаются исследованиям старения, давайте рассмотрим, как проводятся эксперименты по измерению продолжительности жизни у червей. Вкратце, эти эксперименты включают в себя сбор родительских червей, синхронизацию возраста их потомства, обработку личинок червей препаратом для подавления размножения и, наконец, перенос червей на тестовые планшеты и подсчет мертвых или живых червей.
В начале процедуры необходимо получить достаточное количество соответствующих по возрасту животных путем синхронизации партии глистов со всеми отложенными яйцами одновременно. Для этого первых червей оставляют на одной и той же культурной тарелке примерно на одну неделю, что позволяет им потреблять всю доступную пищу, и тем самым вызывает голод. Некоторые из голодающих личинок червей войдут в выносливое, остановленное в росте состояние, называемое «дауэр». Затем эти личинки дауэра перемещаются на свежую тарелку. В этой богатой пищей среде личинки дауэра возобновят свой жизненный цикл и станут репродуктивно зрелыми молодыми особями.
Наконец, через два дня этих взрослых червей перекладывают на другую свежую тарелку и оставляют откладывать яйца на срок до 24 часов. После того, как собрано достаточное количество яиц, взрослых особей извлекают из тарелки, и яйца инкубируют при температуре 20°C в течение 2-3 дней, чтобы позволить червям вылупиться и вырасти до личинковой стадии L4.
Чтобы измерить продолжительность жизни червей, эти личинки переносятся в планшеты, содержащие препарат FUDR, который подавляет размножение червей, не влияя на продолжительность жизни взрослой особи. В ходе эксперимента, чтобы определить, живы черви или мертвы, пластину можно постучать, чтобы наблюдать за движением червей. Для более старых червей может потребоваться осторожное поглаживание головы червя, чтобы вызвать ответную реакцию. Удаляйте мертвых червей и записывайте количество мертвых и живых червей. Животных следует пересаживать на свежие тарелки каждые 2-3 дня, чтобы избежать голодания.
Теперь, когда мы показали вам количественную оценку продолжительности жизни у червей, давайте рассмотрим, как это делается у плодовых мушек. Вкратце, процедура включает в себя разрешение самкам откладывать яйца в специальной клетке, сбор яиц, позволять личинкам развиваться в мух, сортировку мух по признаку пола и, наконец, подсчет мертвых мух, которые появляются со временем.
Чтобы получить мух соответствующего возраста, взрослых мух помещают в клетку для сбора яиц, в которой находятся пластины фруктового сока-агара, прорезанные дрожжевой пастой. Собранные яйца промывают, помещают в бутылки для роста личинок и инкубируют около 10 дней, чтобы мухи развились. Затем однодневных взрослых мух пересаживают в бутылки с кормом для взрослых и инкубируют в течение двух дней, чтобы они достигли половой зрелости.
Затем этих мух собирают, обезболивают и сортируют на самцов и самок, чтобы не смешивать измерения продолжительности жизни с факторами, специфичными для пола. Далее однополые мухи помещаются в ростовые флаконы. Каждые два дня мух следует «переворачивать» в новые флаконы со свежим кормом. Мертвых мух оценивают путем подсчета тех, которые остались в старом флаконе, а также тех, которые упали в новый флакон.
Теперь, когда вы изучили основные протоколы измерения продолжительности жизни в моделях беспозвоночных, давайте посмотрим, как ученые адаптируют эти методы к изучению биологии старения и долголетия.
Исследователи изучают влияние различных факторов, таких как температура и лекарства, на продолжительность жизни. В этом конкретном исследовании ученые культивировали червей в жидких средах в 96-луночных микротитровальных планшетах, чтобы можно было одновременно проверить эффекты нескольких веществ и условий роста. Они обнаружили, что, например, выращивание червей при температуре 25°C, а не 20°C, сокращает продолжительность жизни червей, как и высокие концентрации антидепрессанта миртазепина.
Анализ продолжительности жизни также может сочетаться с такими методами, как РНК-интерференция, или РНК-интерференция, для выявления генов, влияющих на выживание животных. РНК-интерференция — это мощный экспериментальный метод, который использует короткие РНК для снижения или «подавления» уровня экспрессии гена-мишени. Здесь ученые обрабатывали червей РНК-интерференцией против гена bec-1, затем заражали их патогенными бактериями Salmonella и проводили анализ выживаемости. Черви с нокдауном bec-1 показали заметное уменьшение продолжительности жизни по сравнению с червями, у которых ген экспрессируется нормально.
Наконец, эксперименты по количественной оценке продолжительности жизни используются для оценки влияния различных условий роста на продолжительность жизни животных. В этом эксперименте ученые культивировали червей соответствующего возраста на серии пластин с различным количеством бактериальной пищи. Было замечено, что этот режим роста, называемый калорийным или диетическим ограничением, оказывает значительное влияние на продолжительность жизни червей.
Вы только что посмотрели видео JoVE о количественной оценке продолжительности жизни на моделях беспозвоночных. В этом видео обсуждаются некоторые принципы старения и продолжительности жизни, протоколы измерения продолжительности жизни у червей и мух, а также несколько применений экспериментов по измерению продолжительности жизни. В конечном счете, есть надежда, что эти эксперименты помогут ученым найти факторы и пути, которые контролируют старение, и позволят разработать методы лечения возрастных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и сердечно-сосудистые заболевания. Спасибо за просмотр!
Эксперименты по количественной оценке продолжительности жизни позволяют ученым изучить влияние генетики и окружающей среды на продолжительность жизни организма. Беспозвоночные модельные организмы, такие как плодовая муха Drosophila melanogaster и круглый червь Caenorhabditis elegans, оказались чрезвычайно полезными в этом отношении. Проводя эксперименты, которые измеряют и манипулируют продолжительностью жизни этих организмов, ученые начали выяснять факторы, влияющие на процесс старения.
В этом видео вы узнаете о некоторых принципах, лежащих в основе определения продолжительности жизни и старения, об основных протоколах измерения продолжительности жизни червя и плодовой мушки, а также о способах применения этих экспериментов.
Прежде чем рассматривать экспериментальные процедуры для измерения продолжительности жизни, важно сначала понять, что такое продолжительность жизни и старение.
Продолжительность жизни — это количество времени, в течение которого организм живет и функционирует между рождением и смертью. Некоторые организмы, как и многие растения, теоретически могут жить вечно. Между тем, большинство животных естественным образом перестают расти, даже в идеальных условиях, после чего они стареют или «стареют» до самой смерти.
Ученые до сих пор до конца не понимают, почему организмы стареют. Различные факторы, в том числе радиационный и химический ущерб от окружающей среды, а также токсичные побочные продукты наших собственных метаболических процессов, играют роль в старении.
Чтобы изучить эти факторы, исследователи использовали короткое время генерации беспозвоночных модельных организмов, таких как черви и мухи, что позволяет ученым наблюдать за несколькими поколениями в течение нескольких дней или недель, а не месяцев, как в случае с моделями млекопитающих, таких как мыши. Они также вполне поддаются генетическим манипуляциям, с помощью многих доступных инструментов, которые позволяют легко включать или выключать определенные гены, чтобы наблюдать за их влиянием на процесс старения.
Теперь, когда мы узнали, почему модели беспозвоночных так хорошо поддаются исследованиям старения, давайте рассмотрим, как проводятся эксперименты по измерению продолжительности жизни у червей. Вкратце, эти эксперименты включают в себя сбор родительских червей, синхронизацию возраста их потомства, обработку личинок червей препаратом для подавления размножения и, наконец, перенос червей на тестовые планшеты и подсчет мертвых или живых червей.
В начале процедуры необходимо получить достаточное количество соответствующих по возрасту животных путем синхронизации партии глистов со всеми отложенными яйцами одновременно. Для этого первых червей оставляют на одной и той же культурной тарелке примерно на одну неделю, что позволяет им потреблять всю доступную пищу, и тем самым вызывает голод. Некоторые из голодающих личинок червей войдут в выносливое, остановленное в росте состояние, называемое «дауэр». Затем эти личинки дауэра перемещаются на свежую тарелку. В этой богатой пищей среде личинки дауэра возобновят свой жизненный цикл и станут репродуктивно зрелыми молодыми особями.
Наконец, через два дня этих взрослых червей перекладывают на другую свежую тарелку и оставляют откладывать яйца на срок до 24 часов. После того, как собрано достаточное количество яиц, взрослых особей извлекают из тарелки, и яйца инкубируют при температуре 20°C в течение 2-3 дней, чтобы позволить червям вылупиться и вырасти до личинковой стадии L4.
Чтобы измерить продолжительность жизни червей, эти личинки переносятся в планшеты, содержащие препарат FUDR, который подавляет размножение червей, не влияя на продолжительность жизни взрослой особи. В ходе эксперимента, чтобы определить, живы черви или мертвы, пластину можно постучать, чтобы наблюдать за движением червей. Для более старых червей может потребоваться осторожное поглаживание головы червя, чтобы вызвать ответную реакцию. Удаляйте мертвых червей и записывайте количество мертвых и живых червей. Животных следует пересаживать на свежие тарелки каждые 2-3 дня, чтобы избежать голодания.
Теперь, когда мы показали вам количественную оценку продолжительности жизни у червей, давайте рассмотрим, как это делается у плодовых мушек. Вкратце, процедура включает в себя разрешение самкам откладывать яйца в специальной клетке, сбор яиц, позволять личинкам развиваться в мух, сортировку мух по признаку пола и, наконец, подсчет мертвых мух, которые появляются со временем.
Чтобы получить мух соответствующего возраста, взрослых мух помещают в клетку для сбора яиц, в которой находятся пластины фруктового сока-агара, прорезанные дрожжевой пастой. Собранные яйца промывают, помещают в бутылки для роста личинок и инкубируют около 10 дней, чтобы мухи развились. Затем однодневных взрослых мух пересаживают в бутылки с кормом для взрослых и инкубируют в течение двух дней, чтобы они достигли половой зрелости.
Затем этих мух собирают, обезболивают и сортируют на самцов и самок, чтобы не смешивать измерения продолжительности жизни с факторами, специфичными для пола. Далее однополые мухи помещаются в ростовые флаконы. Каждые два дня мух следует «переворачивать» в новые флаконы со свежим кормом. Мертвых мух оценивают путем подсчета тех, которые остались в старом флаконе, а также тех, которые упали в новый флакон.
Теперь, когда вы изучили основные протоколы измерения продолжительности жизни в моделях беспозвоночных, давайте посмотрим, как ученые адаптируют эти методы к изучению биологии старения и долголетия.
Исследователи изучают влияние различных факторов, таких как температура и лекарства, на продолжительность жизни. В этом конкретном исследовании ученые культивировали червей в жидких средах в 96-луночных микротитровальных планшетах, чтобы можно было одновременно проверить эффекты нескольких веществ и условий роста. Они обнаружили, что, например, выращивание червей при температуре 25°C, а не 20°C, сокращает продолжительность жизни червей, как и высокие концентрации антидепрессанта миртазепина.
Анализ продолжительности жизни также может сочетаться с такими методами, как РНК-интерференция, или РНК-интерференция, для выявления генов, влияющих на выживание животных. РНК-интерференция — это мощный экспериментальный метод, который использует короткие РНК для снижения или «подавления» уровня экспрессии гена-мишени. Здесь ученые обрабатывали червей РНК-интерференцией против гена bec-1, затем заражали их патогенными бактериями Salmonella и проводили анализ выживаемости. Черви с нокдауном bec-1 показали заметное уменьшение продолжительности жизни по сравнению с червями, у которых ген экспрессируется нормально.
Наконец, эксперименты по количественной оценке продолжительности жизни используются для оценки влияния различных условий роста на продолжительность жизни животных. В этом эксперименте ученые культивировали червей соответствующего возраста на серии пластин с различным количеством бактериальной пищи. Было замечено, что этот режим роста, называемый калорийным или диетическим ограничением, оказывает значительное влияние на продолжительность жизни червей.
Вы только что посмотрели видео JoVE о количественной оценке продолжительности жизни на моделях беспозвоночных. В этом видео обсуждаются некоторые принципы старения и продолжительности жизни, протоколы измерения продолжительности жизни у червей и мух, а также несколько применений экспериментов по измерению продолжительности жизни. В конечном счете, есть надежда, что эти эксперименты помогут ученым найти факторы и пути, которые контролируют старение, и позволят разработать методы лечения возрастных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и сердечно-сосудистые заболевания. Спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why are fruit flies and roundworms used to study aging and lifespan?
Invertebrate model organisms like Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans have short generation times, allowing scientists to observe multiple generations over days or weeks rather than months. They are also highly amenable to genetic manipulation with tools that enable specific genes to be turned on or off easily, making them ideal for examining genetic and environmental influences on aging.
Q2: What is the dauer stage and why is it important in worm lifespan experiments?
Dauer is a hardy, growth-arrested state that worm larvae enter when starved. To synchronize age-matched worms for lifespan studies, researchers induce dauer by starving worms on a culture plate for approximately one week. When transferred to food-rich environments, dauer larvae resume their life cycle and become reproductively mature, allowing scientists to obtain cohorts of uniformly aged animals for consistent experimental measurements.
Q3: How does FUDR treatment support lifespan measurement in worms?
FUDR is a drug that suppresses worm reproduction without affecting adult lifespan, making it essential for accurate lifespan quantification. By preventing reproduction, FUDR eliminates confounding variables from offspring and allows researchers to focus solely on measuring the survival of individual worms over time without interference from progeny.
Q4: What steps are involved in preparing age-matched fruit flies for lifespan studies?
Adult flies are placed in an egg collection cage with fruit juice-agar plates and yeast paste. Collected eggs are washed and incubated for about 10 days to develop into flies. One-day-old adults are transferred to food bottles for two days to reach sexual maturity, then anaesthetized and sorted by sex to avoid confounding lifespan measurements with sex-specific factors.
Q5: How can RNAi be combined with lifespan assays to study aging?
RNA interference, or RNAi, uses short RNAs to decrease the expression level of target genes. Scientists can treat worms with RNAi against specific genes, then perform survival assays to observe how gene knockdown affects lifespan. This technique helps identify genes that influence animal survival and aging processes by comparing lifespan in knockdown organisms versus controls with normal gene expression.
Q6: What environmental factors have been shown to influence invertebrate lifespan?
Temperature, drugs, pathogens, and diet significantly affect lifespan in invertebrate models. For example, growing worms at 25°C rather than 20°C decreased lifespan, as did high concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Caloric or dietary restriction has also been observed to have significant effects on worm lifespan, demonstrating how growth conditions directly impact longevity.
Q7: How are high-throughput lifespan experiments conducted in invertebrates?
Researchers culture worms in liquid media in 96-well microtiter plates to test multiple substances and growth conditions simultaneously. This approach allows scientists to screen the effects of various drugs, environmental factors, and genetic modifications on lifespan in parallel. The data generated helps identify pathways controlling aging and supports the development of therapies for age-related diseases like Alzheimer's and cardiovascular disease.